I.서 론

보리는 세계적으로 많이 소비되는 곡물 중 하나로, 단백 질과 지방, 무기질 등의 영양소를 골고루 함유하고 있어 영양학적으로 매우 우수한 것으로 알려져 있으며 (Ju et al., 2007; Cho, 1995; Jung et al., 1987), 대표적인 섬유질 사료 작물로 옥수수, 쌀, 밀과 함께 가장 많은 양이 생산되는 곡 물 중 하나로서 농가 소득증대 및 농지 이용률 제고에도 크게 기여해왔다 (Lee and Jung, 2003; Kim et al., 2002). 보리는 크게 껍질이 잘 분리되어 사람이 식용으로 사용하 는 쌀보리 (naked barley)와 껍질이 분리되지 않아서 사료로 사용하는 겉보리 (hulled barley)로 나눌 수 있다 (Kim et al., 1999). 쌀보리는 출수 후 일수에 따라 단백질 10.0~13.5%, 지방 3.2~6.5%, 섬유소 3.9~5.4%, 회분 2.0~2.8%, 유리당 1.5~7.0%, 전분 30.7~73.2%로 그 영양성분과 생리활성, 관 능에 큰 차이가 있는 것으로 보고되었다 (Ju et al., 2007). 보리를 20% 첨가한 사료를 비육돈에 급여하면 등지방 두 께가 감소하는 경향을 나타내었으며, 비육후기 옥수수 위 주의 사료 중 60%를 보리로 대체하여 급여시 등지방 두께 가 감소하는 경향을 보였다 (한, 1987; Chung et al., 1998).

국제유가 및 환율의 등락과 곡물 수요의 급증에 따른 국 제곡물가격의 불안정은 사료 원료의 90%를 수입곡물에 의 존하고 있는 국내 양돈산업의 경쟁력을 약화시키는 주요 원인이 된다 (Shin et al., 2008). 최근 양돈 생산비 상승에 대비한 방법으로 수입 배합사료를 대체할 수 있도록 국내 농식품 부산물이나 조사료 등을 사료로 이용하고자 하는 노력을 정부를 비롯하여 많은 축산 농가들에서 기울이고 있으며, 겨울철 유휴지를 활용한 동계작물의 생산을 장려 하고 있다 (Song and Ha, 2007; Lee et al., 2009; Kim et al., 2012; Yun et al., 2009). 하지만 이러한 조사료나 부산 물들은 고섬유성 사료이기 때문에 이를 미생물 발효과정을 거쳐 가축이 소화하기 어려운 cellulose나 lignin의 이용성을 증진시킬 필요가 있다 (Kim et al., 2009). 발효사료는 미생 물을 접종하여 발효시킨 사료로 균체가 포함되어 있어 생 균제의 기능을 가지고 있다 (Cho et al., 2012). 발효사료를 제조하기 위해서는 발효 미생물과 원료사료의 선별이 중요 하다. 현재 발효사료 제조를 위해 많이 사용되는 미생물은 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Bacillus subtillis 등이 있고 (Ghanem et al., 2000), 대부분 혼합 미 생물 제재의 형태로 사용되고 있다. 미생물은 발효과정에 서 사료 내 영양분을 분해하여 증식하고, 발효산물로 생성 된 유기산, 당류 및 미네랄 등은 유익한 미생물의 성장을 촉진한다 (Anugwa et al., 1989). 이렇게 제조 된 발효사료 는 원료사료의 영양성분과 발효과정에서 생성된 유용물질 로 인하여 사료적 가치가 크게 개선될 수 있다 (Cho et al., 2012).

보리의 사료곡물로서의 활용가치는 매우 높으나 높은 수 분함량으로 인하여 그 저장성이 낮으며, 수확 후 탈곡과 건조과정 등의 가공공정이 가격 인상의 요인으로 작용하여 사료로의 이용이 제한되고 있다. 또한 보리 종실의 발효를 통한 저장성과 미생물 분포 변화에 관한 연구는 아직 미미 한 실정이다. 이에 본 연구에서는 동계사료 작물로서 보리 알곡에 대한 활용도 제고와 저장성 증진을 위해 미생물 접 종을 통한 발효 특성을 분석하였다.

II.재료 및 방법

1.재료 및 시약

본 연구에 사용된 쌀보리 종실은 국립식량과학원 김제포 장에서 재배되었으며, 출수 후 35일령에 탈곡하여 바로 실 험실로 이송한 후 발효를 위한 시료로 사용하였다. 쌀보리 종실 중의 미생물 분석을 위한 영양배지 (nutrient agar), MRS 배지, YM배지, McConkey 배지는 BD difco사 (Detroit, MI, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. 또한 질량분석 을 위한 matrix는 Bruker Daltonik사 (Bremen, Germany)의 HCCA matrix (α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, Part NO., 255344)를 구입하여 사용하였다.

2.시료의 준비

수확한 쌀보리 종실 5 kg에 ㈜청미바이오사의 시판 생균 제 (청미락토) 1 g을 증류수 1L에 희석한 후 쌀보리 곡실에 0.2% 농도로 접종하여 500 g씩 용기에 나눠 담아 밀봉하여 처리구로 사용하였다 (BT). 또한 생균제를 접종하지 않은 쌀보리 종실을 동일한 용기에 밀봉하여 대조구로 사용하였 다 (BC). 포장된 쌀보리 종실은 37°C 배양기에서 42일간 저 장하며 0, 3, 7, 28, 42일차에 이화학적 및 미생물학적 분 석을 위한 시료로 사용하였다.

3.쌀보리 종실 내 미생물 균총 분석

쌀보리 종실 내 존재하고 있는 미생물 균총을 분석하기 위하여 시료 1 g에 9 ml의 멸균 희석액을 가하여 1분간 혼 합 (voltexing)한 후 10진 희석법을 이용하여 적절한 배율로 희석하였다. 희석된 시료 1 ml을 취하여 영양배지 (nutrient agar)에 분주한 후 37°C 배양기 (MIR-253, Sanyo, Japan)의 혐기와 호기 조건 하에서 24시간 배양한 후 각각의 단일집 락을 모두 취하여 다시 새로운 영양배지에 도포하여 배양 하였다. 배양된 미생물은 Bruker Microflex TOF mass spectrometer (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)를 이용하여 동정을 수행하였다.

4.질량분석법을 이용한 미생물의 동정

쌀보리 종실로부터 분리된 미생물들은 질소레이저가 장 착된 Bruker Microflex TOF mass spectrometer (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)를 이용하여 ribosomal proteins의 질량분석을 수행하였다. 시료의 분석에 앞서 규 명된 E. coli의 ribosomal proteins (RL36, RS22, RL34, RL33meth, RL32, RL29, and RS19)를 이용하여 질량분석기 를 보정하였다. 미생물은 신선한 집락으로부터 직접 취하 여 시료판 위에 1 μg씩 접종하여 실온에서 건조시킨 후, HCCA matril 2 μl씩을 미생물 시료에 가한 후 다시 실온에 서 건조시켰다. 시료의 분석은 pulsed nitrogen laser (337 nm)를 3 ns 간격으로 10~50회 조사하여 2,000~20,000 Da 질량 범위의 spectrum들을 linear positive mode에서 기록한 후, 4,000~12,000 Da 범위에서 최소 600의 해상도에 이르 도록 레이저 에너지를 조정하였다. 스펙트럼의 획득은 Bruker FlexControl의 자동실행모드 (autoexecute mode)에서 자동 및 수동으로 수행되었으며, 수집된 spectrum의 분석은 Bruker BioTyper^TM 2.0 software를 이용하여 수행하였다. 약 20개의 스펙트럼들로부터 추출한 피크 리스트를 기준으로 각 미생물의 기준 피크 리스트 (the main spectrum)를 산출 하였으며, 스펙트럼의 정렬 후에 nm/z (질량 대 전하의 비 율)이 250 ppm 미만의 피크들을 동일한 것으로 간주하였다.

5.쌀보리 종실의 pH 측정

쌀보리 종실의 pH는 유리전극이 장착된 digital pH meter (Seven Multi^TM, Metler Toledo, USA)를 이용하여 pH를 측 정하였다. 시료 5 g에 증류수 45 ml을 가하여 1분간 혼합 (voltexing)한 후 pH meter를 이용하여 3회 측정하였다.

6.쌀보리 발효과정 중 미생물 수의 변화 분석

쌀보리의 발효과정 중 미생물 수의 변화를 분석하기 위 하여 일반세균과 유산균, 효모 및 대장균 수를 각각 측정 하였다. 준비된 시료들은 1 g씩 취하여 멸균 희석액 9 ml과 혼합한 후, 10진 희석법을 이용하여 적절한 배율로 희석하 였다. 희석된 시료를 1 ml씩 취하여 영양배지와 MRS 배지, YM배지, McConkey 배지에 각각 분주하여 37°C 배양기 (MIR-253, Sanyo, Japan)에서 24시간 배양한 후, 30~300 집 락 사이의 배지를 선택하여 집락을 계수하였다.

7.통계 분석

통계분석은 SAS program for Windows V9.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석 (general linear model) 을 실시하였으며, 처리구 간의 유의적인 차이는 Duncan’s multiple range test에 의하여 5% 유의 수준에서 검정하였다.

III.결과 및 고찰

1.쌀보리 종실 내 미생물 분포

질량분석법을 이용하여 쌀보리 종실로부터 유래하는 미 생물을 동정한 결과는 Fig. 1과 같다. 호기 및 혐기 조건 하에서 분리된 총 122개의 단일집락을 모두 Bruker Microflex TOF mass spectrometer 장비를 이용하여 동정한 결과, 가장 우점하는 균총은 Staphylococcus xylosus (n=30, 24.59%)로 나타났으며, 정확한 동정이 이루어지지 않는 미 지의 균 (no reliable identification)들이 두 번째로 많이 존 재하였다 (n=25, 20.49%). 이 외에도 Staphylococcus 속과 Bacillus 속의 미생물들이 다수 존재하는 것으로 나타나 자 연발효 시 유기산의 생성이 가능한 것으로 사료된다.

Suh et al. (2010)은 우리나라 농경지 토양미생물 분포 조 사 결과, Bacillus가 10⁶ cuf/g 이상으로 다수 존재한다고 보 고하였으며, 이 외에도 자연계, 특히 토양에 널리 분포하는 Acinetobacter 등이 쌀보리 종실에서 동정되는 등 대다수의 미생물들이 쌀보리가 재배된 농경지 토양으로부터 유래하 여 다양한 미생물 분포를 보이는 것으로 사료된다.

2.발효기간 중 쌀보리 종실의 pH 변화

수확된 쌀보리 종실에 생균제를 접종하지 않은 대조구 (BC)와 접종한 처리구 (BT)의 발효기간 중 pH의 변화는 Table 1과 같다. 발효 개시 후 3일차 (4.98 ± 0.00과 5.44 ± 0.02)와 7일차 (4.33 ± 0.02와 4.83 ± 0.01)에는 생균제를 접종 한 BT의 pH가 BC에 비하여 유의적으로 낮게 나타나 생균 제 내 미생물들이 유기산을 다량 생산하여 쌀보리 종실의 pH 저하속도가 빠른 것으로 나타났다. 그러나 발효 후 숙 성단계에 접어들면서 28일차 이후에는 pH의 차이가 크게 줄어드는 현상을 보였다. 이는 유산균의 성장이 낮은 pH에 의해 제한되어 일정 수준 이하로 생육이 제한되고, 이로 인하여 생산되는 유기산의 양 또한 제한되기 때문으로 사 료된다.

또한, 발효 28일차 이후부터는 생균제를 접종하지 않은 BC의 pH가 4.5 부근으로 나타나 발효가 이루어졌음을 알 수 있었으며, 이는 비록 속도의 차이는 있으나 앞서 쌀보 리 종실로부터 동정된 Staphylococcus속과 Bacillus속의 미 생물들이 유기산을 생산하여 자연발효를 일으키는 것으로 사료된다. Kim et al. (2009)은 미생물 첨가를 통한 총체보 리 사일리지 제조 시 미생물의 첨가로 발효가 활발히 일어 나 다량의 젖산이 생성되어 pH의 저하가 일어났다고 보고 하였으며, 이는 본 연구의 결과와 일치하였다.

발효사료 제조 시 첨가제의 활용은 품질과 사료가치를 개선시키는 요인이 된다. 다양한 발효사료 첨가제 중에서 미생물을 이용한 첨가제가 많이 이용되고 있는데, 이는 처 리하기도 쉽고 인체에 무해하며 가격도 저렴한 장점이 있 다. 또한 미생물 첨가제의 사용은 발효 초기에 pH의 저하 를 촉진시키고 homo형 젖산발효를 일으켜 발효효율을 높 이며, 단백질 분해를 감소시켜 (Seale, 1986) 최종적으로 가 축의 생산성 향상을 기대할 수 있게 된다 (McDonald and Edwards, 1976). 유산균 첨가제의 처리는 젖산을 다량 생산 케 하고, pH를 4.0 부근으로 빠르게 저하시켜 발효사료를 안정시키게 하며, 특히 homo형 미생물의 우점으로 발효과 정 동안 건물손실을 줄이고, 젖산 생성이 많아 pH의 감소 가 초산이나 에탄올 등이 생성되는 hetero형에 비해 효과적 으로 일어나게 된다. 그러나 발효기질이 불충분하면 첨가 제의 처리 효과는 낮아지게 된다 (Stockes, 1992).

3.발효기간 중 쌀보리 종실의 미생물 수 변화

쌀보리 종실의 발효기간 중 미생물 수의 변화는 Table 2 에 나타난 바와 같다. 발효 7일차까지 BT와 BC 모두 일반 세균, 유산균 및 효모의 수가 증가하였으나, 이후 28일과 42일차에는 그 수가 감소하는 경향을 보였다. 또한 전체 발효기간 중에 BC에 비하여 BT에서 일반세균과 유산균 수가 높은 경향을 보였다. 그러나 가장 많은 유산균 수를 보인 발효 7일차에 BT와 BC가 각각 9.24 ± 0.20과 9.01 ± 0.10 logCFU/g으로 큰 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 이 는 쌀보리 종실에 다수의 유산균이 이미 존재하고 있었던 결과에 기인하는 것으로 사료된다. Cai (2005)는 여러 가지 유산균 중에서 Lactobacillus plantarum이 사일리지 발효에 가장 큰 효과를 나타낸다고 보고하였으며, 본 시험에 이용 된 ㈜청미바이오사의 시판 생균제 또한 Lactobacillus plantarum을 함유하고 있어 맥류 종실 발효 시 첨가효과가 인정된다.

한편, 발효 전 높은 수준으로 검출되었던 대장균 (7.54 ± 0.35)은 발효기간이 증가함에 따라 유의적으로 감소하여, 발효 7일차 이후로는 BT와 BC 모두에서 전혀 검출되지 않아, 발효가 쌀보리 종실의 안전성 증진에 크게 기여하는 것으로 나타났다.

IV.요 약

본 시험은 동계작물인 쌀보리의 알곡에 대한 사료로서의 활용도를 제고하고자 미생물 분포를 분석하고, 발효과정 중 이화학적 및 미생물학적 특성의 변화 분석을 통하여 효 과적인 발효사료 제조방법을 제시하고자 수행하였다. 즉, 수확된 쌀보리 종실에 시판 생균제를 기준에 맞게 접종한 후 공기와 접촉하지 않도록 밀봉하여 37°C에서 7일간 발 효를 통해 쌀보리 종실의 저장성과 안전성을 증진시킬 수 있다.

쌀보리 종실 자체에 Staphylococcus속과 Bacillus속의 미 생물들이 다수 존재하여 자연발효의 가능성이 있음을 보여 주었다. 또한 생균제를 접종하지 않은 쌀보리 종실도 기간 이 경과됨에 따라 산도가 저하되고 유산균 수가 증가하여 발효가 이루어지고 있는 것으로 나타났다. 그러나 쌀보리 종실에 생균제를 접종하였을 경우, 발효 7일차에 pH가 4.33±0.02로 발효가 더 빨리 진행되었으며, 유산균의 수도 전체 발효기간 동안 미 접종 대조구에 비해 높게 유지되었 으나, 효모의 수에 있어서는 차이가 나타나지 않았다. 발효 에 의해 쌀보리 종실의 산도가 저하됨에 따라 초기 107 cfu/g 이상 검출되었던 대장균이 발효 7일차 이후부터는 전 혀 검출되지 않아 발효가 쌀보리 종실의 안전성을 유지시 키는 데 있어 효과적인 저장방법으로 나타났다.