Ⅰ. 서 론
사일리지 생산은 고대 이집트(1,500-1,000 BC)에 동물 사료로 식물 원료를 저장하였다는 증거로 보아 오랜 전통의 역사를 가지 고 있다(Alonso et al., 2013). 사일리지 제조는 온대 지역에서 조 사료를 저장하는 대표적 방법으로 1960년대부터 전 세계적으로 급 속히 증가하였다(Cheli et al., 2013). 사일리지는 농가에서 광범위 하게 사용하고 있고, 축우생산 시스템에서 실질적 역할을 하고 있 다. 현재, 사일리지의 품질은 화학적 발효 특성에 의하여 평가되고 있다. 그러나 박테리아, 곰팡이 및 이들의 대사산물(mycotoxins)은 가축의 생산과 건강에 영향을 주기 때문에 이들에 대한 고려가 반드시 이루어져야한다.
국내 조사료 확보를 위한 정부의 노력이 지속되는 가운데 가 을 추수한 논에서 볏짚 원형곤포 사일리지가 있는 광경을 보는 것은 그리 어려운 일이 아니며, 이들 사일리지는 농장으로 운송 보관되어 동절기 동안 급여되거나 논에 야적되어 있다가 이듬해 봄에 운송되어 가축에게 연중 급여되기도 한다. 겨울이 지나 따 뜻해진 봄에 이들을 가축에게 급여하기 위해 풀어 헤쳤을 때 곰 팡이에 오염되어 있는 것을 종종 발견할 수 있으며 다소의 오염 된 볏짚 곤포는 그대로 급여하기도 한다. Sung et al.(2011)은 곰 팡이 발생이 육안 식별이 안 되는 것부터 오염이 심한 것까지 다 양한 볏짚을 수거하여 곰팡이를 배양하여 조사한 결과, 볏짚 곤 포사일리지의 곰팡이 오염은 흰색, 재색, 푸른색 및 검은 갈색 등 다양한 곰팡이가 오염된 것을 발견하였다. 그리고 곰팡이 오염도 는 평균 2.1x106 cfu g-1이었고 시료의 42%가 곰팡이독소에 오염 되어 있었다. 특히, 외관상 곰팡이 오염 식별이 안 되는 정상적인 볏짚 곤포사일리지의 시료에서도 오염이 발견되었다는 것이다. Mamun et al.(2002)도 방글라데시의 볏짚에 곰팡이 오염과 영양 가치 저하의 심각성에 대하여 보고한바 있다. 또한 Auerbach et al.(1998)도 목초 및 옥수수 사일리지에서도 유사한 곰팡이독소 의 오염에 대한 위험성을 관찰 하였다.
사일리지를 저장하는 기간 동안 수확한 볏짚, 주변 환경 및 미생 물 사이의 복잡한 관계 속에 품질에 영향을 미치는데 영상온도에 서 공기와 수분이 존재하는 자연생태환경은 조사료에 Aspergillus sp.를 비롯한 여러 종류의 곰팡이 오염과 성장을 일으킨다(Sung et al., 2011;Sebunya and Yourtee, 1990;Nelson, 1993). 이러한 곰팡이 오염은 가축의 사료섭취량 및 효율 저하, 성장 및 생산성 저하, 질병 및 번식 장애 발생 증가를 초래한다. (Fink-Gremmels and Malekinejad, 2007;Morgavi and Riley, 2007;Pestka, 2007;Voss et al., 2007). 그리고 이는 결국 농장의 경제적 손실을 초래 한다 (Huwig et al., 2001;Wu, 2004;Wu, 2006),
따라서 우리나라의 한육우 및 낙농업에서도 양질의 조사료 공 급을 위한 곰팡이 발생 및 mycotoxin 오염으로 인한 심각한 피해 를 인식하여야 한다. 또한 이들 곰팡이 및 곰팡이독소의 오염을 줄이기 위한 노력이 절실히 필요하다. 본 연구는 대표적 국내 자 급 조사료인 볏짚의 보관 과정에서 곰팡이 및 곰팡이 독소의 오염 저감을 위한 효율적 방안을 찾기 위하여 화학적 처리 방법에 따른 효능을 조사하고자 곰팡이가 오염된 볏짚에 암모니아 및 가성소 다를 처리 후 사일리지 저장에 따른 mycotoxin 저감, 발효 품질 및 섬유소 소화에 미치는 효과를 알아 보기 위하여 수행되었다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 곰팡이독소 오염 및 화학처리 볏짚 사일리지 제조
추수직후 볏짚을 2.5-3.0cm로 세절하고 곰팡이독소 분비 곰팡 이 배양물을 볏짚의 2% 수준으로 분주하여 실험용 볏짚을 준비하 였다. 곰팡이독소 분비 곰팡이 배양물은 볏짚곤포 사일리지에서 분 리한 Fusarium sp.와 Aspergillus sp.를 각각 PDB배지에서 25℃에 서 5일간 배양하고 멸균한 배양액을 사용하였다(Sung, 2013).
실험용 볏짚 사일리지는 준비된 곰팡이 독소에 오염된 볏짚에 암 모니아수를 이용 암모니아가 4% 수준이 되도록 처리하고, NaOH 용액을 이용 NaOH가 4% 수준이 되도록 각각 처리하였다(Sung, 2014, Shin et al., 1989). 그리고 최종적으로 사일리지의 수분이 65%가 되도록 하여 각각 처리구별 3개씩 용량 70ml 밀폐용 플 라스틱 용기에 답압 및 밀폐하여 준비하였으며 4개월 동한 저장 후 개봉하여 분석에 사용하였다.
2. 사일리지의 pH 및 유기산 조사
볏짚 사일리지의 pH 측정은 각 시험시료 25g을 증류수 125㎖ 에 넣어 4℃ 냉장 조건에서 24시간 진탕한 후 4중 거즈로 1차 거 른 뒤 여과지 (Whatman No. 6)를 통과한 추출액을 조제하여 pH 미터측정기(HI 9024; HANNA Instrument Inc., UK)를 이용하 여 측정하였다.
유기산 분석은 사일리지 추출액은 0.22㎛ 실린지 필터를 사용 하여 여과시킨 다음 Gas Chromatography (6890N, Agilent Co., USA)를 이용하여 Fussell and McCalley (1987)가 제시한 80/120 mesh Carbopack, B-DA/4% Carbowax(Supelco Inc., Bellefonte, PA, Catalog No. 1-1889) 컬럼을 이용하여 분석하였다. 추출액은 분석에 이용할 때까지 －70℃에서 냉동 보관 관리하였다.
3. 사일리지내 곰팡이독소 분석
볏짚 사일리지의 mycotoxin 오염조사는 냉장보관 시료를 HPLC (UltiMateTM 3000 UHPLC System, Thermo ScientificTM, USA) 를 이용하여 9종의 mycotoxin 즉, aflatoxins(B1, B2, G1, G2), zearalenone, deoxynivalenol, fumonisin (B1, B2), ochratoxins A 등을 분석하여 곰팡이 독소의 오염실태를 조사하였다.
시료를 건조 및 분쇄하고 10g을 20ml의 acetonitrile을 사용하 여 30분간 진탕 추출한 후 5분간 원심분리한 뒤 상층액 10ml을 취해 Oasis® HLB SPE cartridge(200mg, 6cc)를 사용하여 추출액 을 정제하고, 증류수로 세척한 후 시료를 6ml의 100% methanol을 사용하여 용출시켰다. 용출된 시료를 50℃에서 N2 gas를 사용하여 건조하고 1ml의 methanol/ammonium acetate(10 mmol/L)(1:1, v/v)의 혼합용매로 다시 용해시킨 후 분석에 사용하였다. 시료의 aflatoxin, ochratoxin, zearalenone, fumonisin 분석은 HPLC를 이 용한 선행연구(Hammond et al., 2004;Akiyama et al.,, 2001;Caloni et al.,, 2000;Li et al., 1997;Xiao et al., 1996; Visconti and Pascale, 1998)에서 사용한 방법을 기초로 fluorescence detector 를 사용하여 측정하였다. DON은 Mateo et al. (2001) 및 Visconti and Battalico(1983)이 사용한 HPLC 방법을 기초로 UV detector 를 사용하였다.
4. NDF 및 ADF의 in situ 소화율 분석
In situ 실험을 위하여 반추위에 캐놀라가 설치된 550 kg 거세 홀스타인종을 사용하였고, NDF 및 ADF의 in situ 소화율을 평 가 하였다. In situ 소화율 시험은 nylon bag technicque(Mehrez and Orskov, 1977)을 개량하여 100 mesh (0.149 mm) 나일론 천을 9 × 15 cm 크기로 제작한 nylon bag에 4.0 g 정도의 시료 를 넣고 입구를 봉하여 준비하였다. 그리고 준비된 nylon bac 시 료는 공시축의 rumen fistula를 통하여 반추위 후부 깊숙이 넣어 0, 12, 24, 48 및 72시간까지 방치하였다. 시간대별 회수한 nylon bag은 흐르는 멸균 증류수에 맑은 물이 나올 때까지 가볍게 세척 후 냉동 건조하였다.
NDF 및 ADF 소화율은 in situ 실시 전과 후의 시료의 NDF 및 NDF 함량 차이를 백분율로 환산하여 평가 하였으며, NDF와 ADF 함량은 Van Soest et al.(1991)과 Goering and Van Soest(1970)의 방법으로 분석하였다.
5. 통계처리
본 실험에서 얻어진 모든 자료에 대한 통계분석은 Statistical Package for the Social Sciences(SPSS, 2017)를 이용하였으며, 처 리 평균치 간의 유의성 분석은 Duncan(1955)의 Multiple Range Test에 의거하여 5% 수준에서 검정하였다.
Ⅲ. 결과 및 고찰
1. 곰팡이독소 저감에 대한 효과
본 실험은 조사료로서 볏짚의 곰팡이 독소 오염 저감을 위한 효율적 방안을 연구하기 위하여 볏짚 사일리지 제조과정 중 화학 적 처리 방법을 도입 수행하였다. 화학적 처리로서 암모니아 및 가성소다를 이용 곰팡이독소에 오염된 볏짚의 4% 수준으로 각각 처리하고 사일리지 저장에 따른 곰팡이독소 함량을 측정한 결과 Table 1과 같다.
화학적 처리 없이 사일리지를 담근 대조구, 암모니아를 처리 후 사일리지를 담근 암모니아 처리구 및 가성소다 처리 후 사일리지 를 담금 가성소다 처리구 모두에서 Aflatoxin B1, B2, G1, G2 그리고 Fomonisin B1, B2 뿐만 아니라 Dexynivalenol은 검출되지 않았다. 그러나 Ochratoxin A는 대조구의 41.23±5.05μg/kg에 비하여 암모 니아 처리구는 19.25±4.97μg/kg 및 가성소다 처리구는 11.20±1.34μ g/kg으로 더 낮은 함량을 나타냈다(p<0.05). Zearalenone는 암모니 아 처리구가 대조구의 62.63% 수준으로 낮은 경향을 보였다. 그 리고 가성소다 처리구는 대조구의 45.55% 수준의 매우 낮은 zearalenone함량을 나타내었다(p<0.05).
사일리지에 사용하는 조사료 원료들은 효모 및 곰팡이와 자연 적 접촉이 이루어지며, 사료 작물포에서 자주 오염이 발생할 뿐 만 아니라 수확, 운송 및 저장 기간 동안에도 발생 할 수 있다 (Alonso et al., 2013). 그리고 사일리지는 혐기조건에서 유산발 효에 의하여 저장되어지는 사료 저장시스템으로 물리적, 화학적 또는 생물학적 첨가 및 처리에 따라 품질과 영양적 가치가 달라 질 수 있는 인위적 생태시스템이라 할 수 있다(Alonso et al., 2013). Atanda et al.(2013)은 곰팡이독소를 제거하기 위하여 가 장 효율적 방법으로 화학적 처리방법이 사용되어오고 있음을 보 고하였고, 암모니아, 가성소다 및 중탄산나트륨을 사용한 알카리 조건에서 ochratoxin A, tichothecenes, zeaalenone, rubratoxin 등의 분자가 파괴될 수 있음을 보고하였다. 그리고 Brekke et al. (1977)은 ammonia gas 또는 ammoniumsalt을 이용하였고, Mashaly et al.(1983)과 Moerch et al.(1980)은 NaOH를 이용하여 유사한 연구결과를 보고한바 있다.
이상의 연구 결과에서와 같이 본 실험에서 검출된 곰팡이독소 ochratoxin A와 zearalenone의 함량이 암모니아 및 가성소다 처리 구에서 감소됨을 고찰할 때 암모니아 및 가성소다 처리가 볏짚 사 일리지의 오염 곰팡이독소 저감에 도움이 되는 것으로 사료된다.
2. 볏짚 사일리지의 유기산 발효에 미치는 영향
화학처리에 따른 볏짚 사일리지의 pH 및 유기산 함량의 변화 는 Table 2와 같다. pH는 대조구가 4.63±00, 암모니아 처리구가 4.55±0.01 및 가성소다 처리구가 8.19±0.02로 암모니아 처리구 가 가장 낮았고 가성소다 처리구가 가장 높았다(p<0.05). Lactic acid는 대조구와 암모니아 처리구가 각각 10.85±0.51 및 10.98± 1.01mM로 유사한 수준을 보였으며, 가성소다 처리구가 8.80± 0.45mM로 대조구 및 암모니아 처리구에 비하여 낮은 수준을 나 타내었다(p<0.05). 이상의 실험 처리구별 pH 및 lactic acid 함량 의 결과는 대조구 및 암모니아 처리구가 가성소다 처리구에 비하 여 사일리지 발효가 다소 효과적으로 일어났음을 시사한다고 사 료되며, 가성소다 처리구의 pH는 가성소다의 영향에 의하여 나 타난 현상으로 사료된다.
Lee (2000)은 당밀첨가 볏짚 사일리지의 pH는 4.3 및 4.2로 본 연구 결과보다 다소 낮았고, Jo et al.(2000)은 사과박 첨가 볏짚 사일리지의 품질 연구에서 사과박 첨가량 증가에 따라 pH 3.9까 지 낮아지는 것을 보고하였으나 대조구의 pH는 4.6으로 본 연구 의 대조구와 유사한 수준을 나타내었다. 그리고 Kim et al.(2004) 는 생볏짚의 부위별 원형곤포사일리지에서 pH6.4에서 5.5까지 다양한 범위의 결과를 보고된바 있다. Lactic acid 함량은 당밀 첨가에 의하여 1.74% 이상 나타났고(Lee. 2000), 사과박 첨가량 이 40%이상에서는 1.03% 이상을 나타내었으나 무첨가 및 20% 첨가에서는 각각 0.02 및 0.05%로 상당히 낮은 수준의 결과를 보고한바 있다(Jo et al. 2000).
Propionic acid는 대조구가 0.55±0.13mM로 암모니아 및 가성 소다 처리구에 비하여 높은 수준을 보였다(p<0.05). 그러나 acetic acid, butric acid, total VFA 및 Lc/Total acid에서는 처리구간 수치적 차이는 있었으나 큰 의미는 발견되지 않았다.
당밀 첨가 볏짚 사일리지의 propionic acid는 0.36-0.41%의 수준을 나타내었고(Lee, 2000), acetic acid 및 butyric acid는 미 생물 첨가 사일리지에서는 각각 0.23-0.38% 및 0.05-0.09% 수준 을 보였다(Kim et al. 2008), 그러나 생볏짚 원형곤포사일리지에 서 acetic acid는 0.00-0.01% 수준을 나타내었고 propionic acid 와 butric acid는 모두 0.00%로 보고된바 있다(Kim et al. 2004).
따라서 사일리지 발효 지표인 pH 및 유기산관련 본 연구의 결 과는 가성소다 처리구 비하여 무처리 및 암모니아 처리구가 다소 유기산 발효가 진행된 결과를 보여주었다. 그러나 더 좋은 효율적 발효를 위하여 암모니아 및 가성소다의 처리 농도 및 발효 증진 물 질에 대한 복합적 연구가 지속적으로 이루어져야한다고 사료된다.
3. 반추위 미생물의 NDF 및 ADF 분해에 미치는 영향
화학처리에 따른 볏짚 사일리지의 반추위 미생물의 NDF 및 ADF의 분해율은 반추위 in situ 실험을 통하여 배양 시간의 경과(0, 12, 24, 48, 72시간)에 따라 측정하였을 때 Fig. 1 그리고 2와 같다.
반추위 미생물에 의한 NDF 분해율은 모든 처리구에서 배양 시간이 경과함에 따라 증가 하였으며, 화학적 처리구가 대조구에 비하여 높은 분해율를 보이며 증가하였다. 가성소다 처리구가 가 장 높은 수준의 분해율을 유지하였고, 다음으로 암모니아 처리구 가 높았으며 대조구가 가장 낮은 수준을 유지하였고 배양 12시 간 이후 모든 시간대에서 통계적 유의차를 나타내었다(p<0.05)
ADF 분해율도 배양시간 동안 NDF 분해율과 같은 경향을 나 타냈으며, 배양 시간 전 구간에서 가성소다 및 암모니아 처리구 모두가 대조구에 비하여 유의적으로 높은 수준의 분해율을 보였 다(p<0.05). 그리고 가성소다와 암모니아 처리구간에는 배양 24 시간 이후부터 가성소다 처리구가 암모니아 처리구에 비하여 유 의적 차이를 보이며 높은 분해율를 나타내었다(p<0.05).
볏짚의 소화율이 낮은 이유는 조섬유 중 95%을 cellulose와 hemicellulose가 차지하고 있으며 소화가 않되는 silica와 lignin 등 이 다량 함유되었기 때문이다( Han and Garett, 1986). 그동안 많 은 연구 결과에 의하면 화학 처리에 의하여 고간류 조섬유, 조단백 질 및 ADF 등의 소화율이 증가되었다고 보고되어 왔다(Herrerasaldana et al., 1982;Sung, 2014). Lee(2000)는 볏짚의 암모니아 및 가성소다와 같은 화학처리가 한우 반추위내 NDF 및 ADF 분 해율 증가를 보고하였다고 보고하였다. 또한 사일리지의 발효 및 효율적 발효가 볏짚 사일리지의 섬유소의 반추위 미생물 분해율에 좋은 영양을 주었다고 보고하였다(Jo et al., 2000;Lee, 2000). 이 와 같은 연구들은 사일리지의 발효 작용이 볏짚의 섬유소 소화에 영향을 주지만 본 연구의 NDF 및 ADF관련 반추위 In situ 분해 율의 높은 결과는 사일리지 제조하기 전에 암모니아 및 가성소다 의 처리가 볏짚 사일지의 소화율 향상에 좋은 영향을 주었음을 명확히 설명한다고 사료된다.
Ⅳ. 요 약
본 연구는 볏짚 사일리지의 곰팡이 독소 저감을 위한 효율적 방안으로 화학적 처리 방법에 따른 효능에 관한 진보적 연구 자 료를 제공하고자 실시하였다. 화학적 처리 방법으로 암모니아 및 가성소다를 이용 곰팡이독소에 오염된 볏짚의 4% 수준으로 각각 처리하고 사일리지 저장에 따른 곰팡이독소 저감, 발효 품질 및 섬유소 소화에 미치는 영향을 평가 하였다.
모든 실험구에서 Aflatoxin B1, B2, G1, G2 그리고 Fomonisin B1, B2 뿐만 아니라 Dexynivalenol은 검출되지 않았으며, Ochratoxin A와 Zearalenone이 검출되었다. 그리고 Ochratoxin A은 대조구 (41.23g/kg)보다 화학적 처리구에서 낮게 검출되었다(p<0.05). Zearalenone은 대조구(600.33μg/kg) 및 암모니아 처리구(376.00 μg/kg)에 비하여 가성소다 처리구(297.44μg/kg)가 더 낮은 결과 를 나타내었다(p<0.05).
볏짚 사일리지의 pH는 암모니아 처리구(4.63)가 가장 낮았고, 가성소다 처리구가 가장(8.19) 높았다(p<0.05). lactic acid 함량은 대조구와 암모니아 처리구(10.85와 10.98mM)는 유사한 수준이었 으나 가성소다 처리구(8.80mM)가 가장 낮았다(p,0.05). Propionic acid는 대조구(0.55mM)가 화학처리구에 비하여 높았으며(p<0.05), 암모니아와 가성소다 처리구간(0.09와 0.07mM)에는 유사한 함 량을 나타내었다.
화학처리에 따른 볏짚 사일리지의 반추위 미생물의 NDF 및 ADF의 분해율 모두 가성소다 처리구가 가장 높은 분해율을 보 였고 다음으로 암모니아 처리구이었으며, 대조구가 가장 낮은 수 준을 나타내었다(p<0.05).
따라서 본 연구결과는 볏짚 사일리지 제조공정에서 암모니아 및 가성 소다 처리가 곰팡이 독소 저감 및 볏짚 사일리지의 반추 위 미생물 분해율 증진에 좋은 영향을 주는 것으로 사료되며, 가 성소다 처리는 암모니아 처리에 비하여 곰팡이 독소 저감 및 섬 유소 분해율 증진에 더 효율적이었으나 사일리지 발효에는 비효 율적 영향을 준 것으로 사료된다.
