Ⅰ. 서 론

산성토양에서 많은 작물들의 생산성은 매우 저하되며 그 이유 는 산성토양에서 특이적으로 활성화 되는 알루미늄 이온 (Al₃⁺) 의 독성 때문으로 알려져 있다 (Kochian et al., 2005). 알팔파는 세계적으로 가장 많이 재배되고 있으나 국내에서 재배는 매우 제 한적이고 어려운 것으로 알려져 있는데, 이는 알팔파가 산성토양 에 매우 민감한 작물이고, 우리나라 대부분의 산지초지토양이 산 성토양이기 때문으로 알려져 있다. 산성토양에서 식물 생육이 저 하되는 가장 큰 이유로는 낮은 pH 조건에서 활성화되는 알루미 늄 (Al₃⁺)의 독성 때문인 것으로 알려져 있다 (Kochian et al., 2015). 알루미늄은 작물의 근계 발달을 저해하며, 수분흡수, 무기 영양원소, 특히 인산의 흡수를 저해하여 영양결핍을 초래하는 것 으로 알려져 있다 (Kochian et al., 2005).

지금까지 연구된 바에 따르면 식물체에 있어서 알루미늄 독성 에 대한 가장 분명한 반응은 뿌리생장의 저해이다. 식물에 있어 서 알루미늄 독성에 대한 대응기작으로는 먼저 식물 뿌리의 세포 에서 근권 주변으로 페놀성 화합물이나 유기산을 분비시켜 알루미 늄을 배제시키거나 배출시킴으로서 알루미늄 이온의 뿌리흡수를 막 는 기작인 ‘Apoplastic mechanism’ (Kochian et al., 2015)과 이미 세포 내로 흡수된 알루미늄 이온을 citrate, malate, oxalate 등의 유 기산 (Taylor, 1988;Ma; Miyasaka, 1998) 또는 특이 단백질과 안 정된 복합체를 형성하거나 복합체를 액포에 저장함으로서 무독화 시키는 기작인 ‘Symplastic mechanism’으로 크게 구분되고 있다 (Kochian et al., 2004). 지금까지 알려진 이와 같은 대표적인 기작 외에 구체적인 알루미늄 작용 기작에 대한 보고는 많지 않다.

최근 알루미늄의 독성이 식물 뿌리의 근단 조직 내에서 O₂^- 또 는 H₂O₂와 같은 활성산소를 발생시키고 (Choudhury and Sharma, 2014; Horst et al., 1992), 벼의 경우 지질과산화와 항산화효소 활성에도 영향을 미치는 것으로 보고 된 바 있다 (Kuo and Kao, 2003; Ezaki et al., 2000). 그러나 아직까지 알팔파 뿌리에 있어 서 알루미늄에 대한 독성 기작과 활성산소 및 항산화 관련 반응 기작은 잘 밝혀져 있지 않다.

따라서 본 연구에서는 알팔파 뿌리에 있어서 알루미늄 스트레 스를 처리했을 때의 뿌리의 생장 및 뿌리조직 내의 생리적인 반 응기작과 항산화 효소의 반응기작을 밝힘으로서, 향후 산성토양 에 있어서 알루미늄 독성에 대한 내성을 가지는 식물체 개발의 기초자료로 활용하고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 식물재료 및 스트레스 처리

실험에 사용한 알팔파 (Medicago sativa L.)는 Vernal과 Gannong 품종을 사용하였다. 종자는 증류수에 3 일간 암상태에서 침지 발 아시킨 다음, 1/2 ×Hoagland salt mixture (Phytotech lab., USA) 배지에서, 25℃, 220 μmol․m^-2․s^-1, 16시간 광조건으로 매 2시간 마다 배지 내로 aeration시키면서 수경재배 하였다. 수경재배 10 일령의 알팔파 유묘를 0.5 mM CaCl₂, pH4.5 배지에서 2일간 계 대배양 한 다음 0, 100, 300, 500 μM의 AlCl3가 첨가된 0.5 mM CaCl₂, pH4.5 배지에 48시간 동안 처리하였다.

2. 뿌리생장 측정

알팔파 뿌리길이는 알루미늄 (Al) 스트레스 처리 전과 48시간 후의 길이를 각 농도별 무작위로 10개의 알팔파 식물체를 선발 하여 각각의 뿌리길이를 측정하였다.

3. 알루미늄 축적의 histochemical 분석

알루미늄 처리 후에 뿌리조직 내에 축적되어 있는 알루미늄은 hematoxylin 염색법 (Awasthi et al., 2017)을 이용하여 분석하였다.

4. H₂O₂와 O₂^- 의 histochemical 측정

H₂O₂의 histochemical 측정은 알루미늄 처리 후 48시간 된 뿌 리조직을 3,3-diaminobenzidine (DAB) 염색법 (Daudi와 O’Brien, 2012)으로 측정하였고, O₂^-의 측정은 nitro blue tetrazolium (NBT) 염색법 (Awasthi et al., 2017)을 이용하여 측정하였다.

5. Lipid peroxidation 측정

Lipid peroxidation 측정에는 lipid peroxide를 생성하는 aldehyde 를 측정하는 Schiff’s reagent를 이용한 염색법 (Awasthi et al., 2018)을 이용하여 측정하였다.

6. 뿌리 단백질 분리 및 항산화효소 활성 측정

각각의 알루미늄 농도별로 처리된 알팔파 유묘의 뿌리 2 g을 0.1 M의 Potassium phosphate buffer (pH 7.0) 6 ml를 첨가한 유발에 서 분쇄하였다. 추출한 용액은 12,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분 리 한 다음 상층액을 이용하여 효소활성을 분석하였다 (Kenyon and Duke, 1985). 단백질 농도는 Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad, USA)을 이용하여 결정하였다. 각 효소의 활성은 spectrophotometer 를 이용하여 흡광도의 변화로 측정하였다. Catelase (CAT)의 활 성은 H₂O₂의 분해에 따른 240 nm에서 흡광도의 변화로 측정하 였다 (Blume and McClure, 1980). Peroxidase (POD)의 활성은 pyrogallol을 기질로 470 nm에서 산화에 따른 흡광도의 변화를 측 정하였으며 (Blume and McClure, 1980), Ascorbate peroxidase (APX)의 활성은 ascorbate를 기질로 290 nm에서 산화에 따른 흡광 도의 변화를 측정하였다 (Nakano and Asada, 1981). Glutathione reductase (GR)의 활성 측정은 340 nm에서 NADPH의 산화에 따 른 흡광도의 변화를 측정하였다 (Schaedle and Bassham, 1997).

7. 통계 처리

알루미늄 처리 농도별 알팔파 뿌리의 상대적 길이의 변화의 유의적 차이 분석에는 일원변량분석과 Tukey 사후검정을 실시하 였다. 각 항산화 효소의 활성 분석에는 독립표본 t 검정을 하였으 며, 유의수준 p<0.05에서 검증하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 알루미늄 스트레스에 따른 뿌리생장 저해

알루미늄(Al) 스트레스 처리가 알팔파 뿌리의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 각각의 Al 농도가 처리된 배지에서 2일 간 수경재배 해 본 결과, Al 농도가 증가할수록 뿌리생장이 급격 하게 저해되었다 (Fig. 1). Vernal과 Gannon 두 품종 간에 유의 적인 차이는 없었으나 Gannong이 높은 Al농도에서의 생장저해 정도가 다소 높게 나타났다. Al처리에 따른 뿌리생장의 저해는 벼(Awasthi et al, 2017)를 비롯하여 여러 가지 식물에서 보고 된 바와 유사한 결과이다.

2. 뿌리 조직에서 Al 스트레스 처리에 따른 Al의 축적 비교

Al 처리농도에 따른 뿌리조직 내의 Al 이온 축적량을 비교해 본 결과, Al 농도가 증가함에 따라 hematoxylin 염색정도가 증가 하였다. 이러한 결과는 배지 내의 Al 농도가 증가할수록 뿌리조 직 내로 Al 이온의 흡수가 증가했음을 나타내는 결과이다. 그러 나 품종 간에 Al 축적량의 차이는 관찰되지 않았다 (Fig. 2).

3. ROS 축적 및 lipid peroxidation

알팔파 뿌리에 있어서 Al 스트레스 처리가 뿌리조직 내의 ROS 의 축적에 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 각각의 Al 농도로 처리된 뿌리 조직을 histochemical staining으로 분석하였다. 세포 내 ROS (O₂^-, H₂O₂) 축적정도를 비교해 본 결과, Al 처리 농도가 증가할수록 O₂^-와 H₂O₂ 두 종의 ROS 모두 축적량이 증가하는 것 으로 나타났다 (Fig. 3A,B). 한편 Al 스트레스에 의해 유도된 ROS의 세포 내 축적이 인지질막의 lipid peroxidation에 영향을 미치는지를 Schiff’s reagent 염색으로 조사해 본 결과, 100 μM 이상의 Al 농도에서 농도가 높아질수록 인지질막의 손상정도가 심한 것으로 나타났다 (Fig. 3C). Vernal과 gannong 품종 간의 손 상정도의 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 이와 같이 Al 스트레 스 처리가 식물체의 근단조직 내에 ROS를 축적시키고 세포막의 손상을 초래한다는 결과가 chickpea (Choudhury and Sharma, 2014)와 대두 (Horst et al, 1992)에서 보고된 바가 있다.

4. 항산화 효소 활성 비교

Al 스트레스가 alfalfa 뿌리조직 내의 항산화 효소의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 500 μM Al 농도로 처리된 뿌리 조직으로부터 total protein을 추출한 후 CAT, POD, APX 및 GR의 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 전체적으로 Al 스트레스 처리에 의하여 항산화효소활성이 다소 증가하는 경향을 나타내 었다. Vernal 품종의 경우 CAT와 APX는 유의적인 활성의 차이 를 보이지 않았으며, POD와 GR은 Al 스트레스 처리에 의하여 유의적으로 활성이 증가하였다. 반면 Gannong의 경우 CAT는 다소 증가하고 APX는 유의적으로 감소하였으나, 나머지 항산화 효소는 거의 변화를 보이지 않았다. 이러한 결과는 두 품종이 Al 스트레스에 의해 생성된 ROS를 무독화 하는데 관여하는 항산화 효소들의 작용기작이 서로 다르게 조절되고 있음을 나타낸다. 이 와 같이 항산화효소가 Al 스트레스에 의해 생성된 세포 내의 ROS 제거 반응에 관여한다는 결과가 벼 등 (Kuo and Kao, 2003; Ezaki et al., 2000)에서 보고된 바 있다. Fig. 4

Ⅳ. 결 론

알팔파 뿌리조직에 있어서 Al 스트레스 처리가 뿌리생장 및 활성산소의 축적에 미치는 영향을 조사해 본 결과, Al 농도가 증 가할수록 O₂^-, H₂O₂ 및 lipid peroxidation 정도가 증가하였다. Al 스트레스에 따른 항산화효소들의 활성에 변화를 조사해본 결과, CAT, POD 및 GR의 활성이 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결 과는 알팔파 뿌리에 있어서 Al 스트레스가 뿌리세포 내에 활성 산소를 발생시키고 이를 제거하기 위해 항산화효소들이 활성화 되었을 것으로 추측된다.