Ⅰ. 서 론

고창증은 반추동물이 트림으로 가스를 배출할 수 있는 양보다 반추위에서 가스가 과다하게 생성될 때 발병한다(Majak et al., 2003). 2001년 6월부터 1년간 서부 캐나다 지역 낙농가에서 실시된 조사에서 총 355 두의 젖소가 폐사했는데, 폐사된 젖소 중 184 두를 사후검사 및 병리조직학적 검사한 결과, 11 두의 젖소가 고창증으로 폐사하였다(Waldner et al., 2009). 인도의 안드라프라데시주 60개의 낙농가 중 39개의 농가에서 부적절한 사료급여와 사양방식으로 인해 송아지에서 고창증이 발병해 경제적인 손실을 초래하였다(Sreedhar and Sreenivas, 2015). 고창 증 예방을 위해 젖소의 영양사료 및 사양관리분야에서 많은 연구가 되어오고 있지만, 아직까지도 고창증은 농가의 주요 경제 적 손실의 원인 가운데 하나이다(Cheng et al., 1998; Wang et al., 2012). 고창증은 유리가스 고창증과 포말성 고창증 두 가지로 나뉜다(Cheng et al., 1998; Wang et al., 2012). 유리가스 고창증은 비정상적으로 과도한 사료섭취로 인해 반추위와 중앙신경계를 연결하는 미주신경의 손상뿐만 아니라 식도와 위 유문의 물리적 막힘으로 인해 발생된다. 특히 외부 이물질로 인해 식도가 막힐 경우, 반추위 발효로 인해 생성되는 가스는 트림으로 배출되지 못해 고창증이 발병되곤 한다(Cheng et al., 1998; Majak et al., 2003). 포말성 고창증은 고단백질 조사료, 미세사료입자 그리고 박테리아가 세포 외 다당류(exopolysaccharide)를 생성하기 좋은 조건이 원인이 되어 발생된다(Howarth et al., 1986; Majak et al., 2003; Wang et al., 2012). 알팔파와 클로버류의 단백질은 용해성 단백질로서 반추위 내 미생물 발효로 인한 가스생성을 빠르게 증가시킨다(Howarth et al., 1986; Majak et al., 2003; Wang et al., 2012). 사료 내 엽록체의 파열로 생성된 미세사료입자 는 반추위 생성 가스와 결합하여 반추위 내 거품 생성을 증가 시킨다(Hironaka et al., 1973; Howarth et al., 1986; Wang et al., 2012). 세포 외 다당류 또는 세균성 점성물질은 반추위 내 박테리아가 증식하기 좋은 조건을 만들어 주며, 미세사료 입자와 함께 반추위 가스와 결합하여 거품을 생성한다(Majak et al., 2003; Wang et al., 2012; Pitta et al., 2014). 많은 양의 알팔파와 곡물 사료를 젖소에게 급여하였을 때 박테리아가 다량 증식되고 세균성 점성 물질이 증가되는데(Majak et al., 2003; Min et al., 2006), 특히 알팔파가 어리고 곡물 사료의 품질이 좋을수록 반추 위 내 미생물 성장이 증가하여 고창증을 자주 일으키곤 한다 (Majak et al., 2003). 최근 연구들에서 사료의 형태나 물리적 사료입자 보다 미생물 생성물이 고창증 발병에 영향을 준다는 결과가 보고되고 있다(Majak et al., 2003; Min et al., 2006; Pitta et al., 2010; Pitta et al., 2016).

따라서, 본 연구를 통해 저지종 젖소의 반추위 내 미생물 균총의 급작스런 변화와 고창증 발병간의 연관성을 알아보고 자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1 공시축 및 공시사료

국립축산과학원 낙농과에서 사양중인 Jersey종 젖소(29개 월령, 507 kg) 가운데 고창증 발병으로 인해 갑작스럽게 폐사 한 젖소의 반추위액과 캐뉼라가 장착된 저지종(42 개월령, 558 kg)으로부터 반추위액 샘플을 각각 채취 하였다. 사료급 여는 국립축산과학원 낙농과 젖소 사양관리 규정에 준하여 젖소가 섬유질배합사료(TMR)를 자유채식 하도록 하였다 (Table 1).

2 미생물 다양성 군집 분석

채취한 저지종 반추위액 샘플을 PowerMax Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Inc., CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 후 PicoGreen(Turner BioSystems, Inc., CA, USA)과 Nanodrop spectrophotometer (ND-1000, NanoDrop Technologies Inc., DE, USA)를 이용하여 260/280 nm와 260/230 nm 흡광도 값을 측정하 였다. DNA를 정량분석하고 MiSeq™ platform (Illumina, CA, USA)을 이용한 16S rRNA 분석을 마크로젠(Macrogen Inc., Seoul, Korea)에 의뢰하여 실시하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1 전분 분해균 변화

반추위 내 전분 및 탄수화물 분해균에 속하는 박테리아 균 은 Streptoccocus bovis, Bifidobacterium spp., Butyrivibrio spp., Ruminococcus bromii 및 Lactobacillus sp 등이 있다(Xia et al., 2015; Pitta et al., 2016). Figure 1에서 보는 바와 같이 저지종 젖소의 반추위액 내 전분 분해균들의 Heat-map 분석 결과에 서는 Ruminococcus bromii가 고창증으로 인해 폐사한 젖소에 서 큰 차이를 보이는 것으로 나타났다. Figure 2에서는 특이 적 차이를 보인 Ruminococcus bromii이외의 대표적인 전분 분해균인 Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium merycicum 그리고 Butyrivibriofibrisolvens의 정상우와 고창증으로 폐사 한 젖소간의 정량 분석 결과를 보여주고 있다 (Figure 2). 특 히, Figure 2에서 보는 바와 같이 정상우에서는 R. bromii 0.48%, B. pseudolongum 0%, B. merycicum 0% 그리고 B.fibrisolvens 0.13%의 전분 분해균이 차지한 반면 고창증으로 인해 폐사한 저지종 젖소에서는 R. bromii 17.93%, B. pseudolongum 1.08%, B. merycicum 0.81% 그리고 B.fibrisolvens 2.46%로서 폐사축에서 전분 분해균 균총의 비율이 훨씬 높은 것을 알 수 있었다. 특히, 전분 분해균의 대표적인 R. bromii는 정상우 보 다 폐사축의 반추위 내 에서 약 36배나 높은 비율을 차지하고 있는 것으로 나타났다. Table 1에서는 저지종 젖소에게 급여 했던 TMR 사료의 주원료 배합비를 보여준다. 두당 43.8kg 급 여량 가운데 잠재적으로 고창증을 유발할 수 있는 원료들은 농후사료 9kg, 대두박 1kg, 옥수수 사일리지 23kg 그리고 알 팔파 3.5kg로서 총 섭취량의 83%에 달한다. 단백질 원료를 제외하고 전분질 사료인 농후사료 및 옥수수 사일리지 비율 만 따져도 총 섭취량의 73%이다. 따라서 폐사우의 경우 사료 골라먹기 등 이상섭취로 인해 반추위 내 균총의 급작스런 변 화로 고창증이 발생한 것으로 판단된다. 이는 Majak 등(2003) 연구에서 유리가스 고창증은 반추동물이 과도한 곡물을 섭취 했을 때 반추위 내 과산증을 유발되고 반추위 운동을 저하시 켜 발생한다고 주장한 결과와 일치한다. 본 연구에서 대표적 인 전분분해균인 R. bromii는 폐사우에서 17.93%로 B. pseudolongum 1.08%, B. merycicum 0.81% 및 B.fibrisolvens 2.46%와 비교 하였을 때 전분 분해균 중에서도 우점 하였다. 정상우에서도 R. bromii는 0.48%, B. pseudolongum과 B. merycicum의 0% 및 B.fibrisolvens 0.13%로서 전분 분해균 중 B. pseudolongum, B. merycicum은 정상우에서 존재하지 않으며 R. bromii가 B.fibrisolvens에 비해 약 4배 많았다. Ze 등(2012)의 연구결과에 서 보면, R. bromii가 다른 전분 분해균보다 분해력이 뛰어날 뿐만 아니라, 다른 전분 분해균의 분해 능력을 강화시켰다. 본 연구에서도 고창증 유발 원인으로 추정하고 있는 R. bromii의 우점 균총변화 결과가 기존 연구와 비슷한 결과를 보여준다.

2 섬유소 분해균 변화

Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus 및 Ruminococcus flavefaciens 등의 균은 반추위 내 대표적인 섬유소 분해균이 다(Koike and Kobayashi, 2001). Figure 3에서 보듯 정상우에 서 R. albus 0.68%, R. flavefaciens 1.61% 그리고 F. succinogenes 1.7%로 차지하고 있는 반면, 폐사우에서는 R. albus 0.26%, R. flavefaciens 0.06% 그리고 F. succinogenes 0%로 정상우에서 약 12배정도 우점하는 것으로 보이고 있다. 이전 연구에서 F. succinogenes은 pH 6.1~6.9의 범위 안에서 정상적인 성장이 가능하다고 보고하였고(Weimer, 1993), R. albus는 pH 6.0에서 R. flavefaciens는 pH 6.2정도에서 성장을 멈춘 것으로 관찰되었다(Russell and Dombrowski, 1980). 따 라서 정상우에 비해 폐사우에서 섬유소 분해균의 균총 군집 이 낮은 것은 폐사우의 반추위 내 pH가 6.0이하로 떨어졌을 것으로 판단된다. 또한 폐사우에서 R. albus의 군집이 가장 높 은 것은 pH 저항성이 R. flavefaciens와 F. succinogenes보다 크기 때문이며, Weimer (1993)의 연구에 따르면 R. flavefaciens와 F. succinogenes의 발효특성이나 성장환경이 비슷하여 두 균 이 같은 환경에서 클 경우 서로 성장을 방해하여 균총의 수가 감소한다고 보고하였다. 반면 정상우에서 R. albus의 수가 가 장 적고, R. flavefaciens와 F. succinogenes의 수치가 비슷한 이유는 반추위 내 적정 pH를 유지하고 섬유소가 풍부해 섬유 소 분해균이 성장하기 좋은 환경 때문인 것으로 판단된다.

3 미생물 균총 변화

Figure 4에서 보다시피 정상우에서 Bacteroidetes는 33.4%, Firmicutes는 39.6%, 폐사우에서도 Bacteroidetes는 24.9%, Firmicutes는 55.1%를 각각 차지하고 있으며 Firmicutes 우점 비율은 정상우보다 폐사우에서 높았다. 본 실험결과와 반대 로 Pitta 등(2010)의 연구에서 젖소에게 고창증을 유발하는 추 파소맥을 급여하였을 때 Bacteroidetes는 증가하였고, Firmicutes는 감소 하였다. 또한 Grilli 등(2016)의 실험에서 염 소에게 알팔파 생초를 급여하였을 때 Bacteroidetes가 증가하 였으며, 염소는 고창증이 발생하였다. 그러나 Pitta 등(2016) 의 실험에서 추파소맥을 급여하였을 때 본 실험과 동일하게 반추위에서 Bacteroidetes는 감소하였고, Firmicutes는 증가하 였다. 따라서 Pitta 등(2016)의 연구에서는 미생물 균총의 단 순한 변화가 고창증 발병의 원인이 아닌 것으로 보고하였고 본 실험의 결과가 이를 뒷받침한다. 또한 Pitta 등(2016)의 연 구에서는 미생물에 의한 생물막 생성을 가속화 시키는 특정 미생물이 고창증의 주요 원인이라 보고 있으며, Grilli 등 (2016) 실험에서도 고창증은 Bacteroidetes 속의 알려지지 않 은 특정한 박테리아균이 일으킨다고 추정하였다. 따라서 본 연구에서는 R. bromii, B. pseudolongum, B. merycicum 및 B.fibrisolvens 등의 전분 분해균 뿐만 아니라 폐사우 반추위 Bacteroidetes에 속하는 알려지지 않는 미생물이 고창증 발병 에 밀접한 관련이 있을 것으로 판단된다.

결론적으로 과다한 농후사료 섭취로 인해 반추위 내 미생 물의 균총 변화 가운데 특정 전분 분해균의 급격한 증식이 반 추위 내 pH를 저하시키고, 반추위 내 가스를 과다하게 생성 하여 고창증 발병으로 인한 폐사와 밀접한 연관성이 있을 것 으로 판단된다.

Ⅳ. 요 약

본 연구는 고창증 발병으로 폐사된 저지종 젖소의 반추위 액과 캐놀라가 장착한 저지종 젖소의 반추위액을 샘플링하여 반추위 내 미생물 균총의 급작스런 변화에 따른 반추위 발효 와 고창증 발병간에 연관성을 알아보고자 진행되었다. 채취 한 반추위액 샘플은 PowerMax Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Inc., CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 후 PicoGreen (Turner BioSystems, Inc., CA, USA)과 Nanodrop spectrophotometer (ND-1000, NanoDrop Technologies Inc., DE, USA)를 이용하 여 260/280 nm와 260/230 nm 흡광도 값을 측정하였다. DNA 를 정량분석하고 MiSeq™ platform (Illumina, CA, USA)을 이 용한 장내 미생물 균총의 다양성 분석을 마크로젠(Macrogen Inc., Seoul)에 의뢰하여 실시하였다. 반추위액 내 미생물 균 총 분석 결과, 전분 분해균의 경우 고창증 발병으로 인한 폐 사우의 반추위 내에서 R. bromii가 우점 하였으며, R. bromii, B. pseudolongum, B. merycicum 및 B.fibrisolvens 등과 같은 전분 분해균들이 정상우 대비 36배 높았다. 반면 반추위 발효 와 밀접한 관련이 있는 F. succinogenes, R. albus 및 R. flavefaciens 등과 같은 대표적인 섬유소 분해균 비율은 정상 우에서 고창증 발병으로 인한 폐사우 대비 12배 높았다. 이와 같은 결과를 볼 때, 반추위 내 균총 가운데 R. bromii, B. pseudolongum, B. merycicum 및 B.fibrisolvens 등과 같은 전 분 분해균들의 급격한 증가가 반추위 내 pH 저하 및 가스 생 성 증가를 초래했고 이는 저지종 젖소의 고창증 발병으로 인 한 폐사와 밀접한 연관이 있었을 것으로 판단된다.