Ⅰ. 서 언

초지 조성에서 종자활력을 향상시키면서 다양한 환경에 대 한 저항성을 증대하고 유묘의 품질향상 등의 효과를 목적으 로한 파종 기술의 개발이 요구되고 있다. 종자 발아 소요일수 단축은 모든 작물에 절실히 요구되며, 비교적 고가의 종자의 균일하고 튼튼한 묘를 생산하기 위한 발아초기 병원균에 대 한 예방이 필요하다. 농업생산 측면에서 볼 때 높은 발아율을 유지할 수 있는 고품질의 종자가 절실하게 요구되며, 이러한 종자를 확보하기 위한 연구가 진행되고 있다(Welbaum and Bradford, 1991). 종자의 높은 발아율과 입모율은 작물의 수량 을 증가시키는 주요한 요인이다(Mckeon and Stumpf, 1982).

목초재배에서 신속하고 균일한 묘 출현은 작물재배에 있어 서 가장 중요한 요소이다. 그 중에서도 목초의 경우 종자의 발아율이 높고 균일하며 발아세가 왕성하여 초기생장이 왕성 한 종자가 요구되고 있다. 미생물을 종자에 처리하여 식물병을 방제하거나 유묘의 생장을 촉진하는 연구는 보고되고 있으나 (Kong et al., 2010), 종자발아에 미치는 효과를 조사한 연구는 많지 않다 (Sa, 2012). 콩나물 재배에 클로렐라를 처리할 경우 부패 없이 재배가 가능하였고 제품의 품질이 뛰어나고 기능성 성분(비타민, isoflavone)의 함량이 높았다고 보고되었다(Kim et al., 2003). 또한 클로렐라에 의한 작물의 저장성 병해 억제 효과에 대해서도 연구되었는데 딸기에 클로렐라를 처리하였더 니 무처리구에 비해 저장성 병해가 약 74% 감소하는 것으로 나타났으며 엽채류의 경우도 클로렐라의 처리구에서 저장성 병해가 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(Kim et al., 2014). 이는 클로렐라 처리가 친환경 농산물의 생육촉진과 기능성물 질의 증대뿐만 아니라 식물병 발생 억제에도 효과적이라 할 수 있다. 클로렐라 배양액은 종자 발아촉진과 작물 생육 촉진 및 수량증대를 목적으로 하여 토양 및 엽면시비용으로 이용되 고 있다(Hong et al., 2007; Khan., et al., 2009).

종자의 발아력 향상을 위한 처리방법은 종자에 물리적, 생 리적 손상을 주지 않는 종자 처리기술 개발이 필요하다. 대부 분의 종자는 농약에 의한 약품처리(Kim et al., 2001)나 소독 에 의존하고 있다. 그러나 종자의 발아단계에서 화학농약을 사용하지 않는 무병화 종자 처리기술은 친환경농업의 필수요 건이지만, 현재까지는 연구가 미흡한 실정이다.

클로렐라는 식량 및 사료 작물과 경쟁하지 않는 바이오매 스로 평가되면서 세계적인 상용화가 진행되고 있으며, 국내 에서는 클로렐라 시용에 따른 다양한 작물의 생육 증진 효과 가 입증되고 있는 상품성 있는 미생물 비료로 자리매김하고 있다(Lee, 2017).

미세조류의 일종인 클로렐라 배양의 가장 큰 장점은 작물 생산에 적합하지 않은 염분이 높거나 강한 알칼리 등의 극한 환경에서도 성장 가능하다는 점이다. 또한 클로렐라는 수중 에서 태양광이나 이산화탄소 등을 이용하여 비교적 적은 비 용으로 대량의 바이오매스를 얻을 수 있고 생산된 바이오매 스는 다양한 종류의 유용물질을 함유한다.

클로렐라 배양액 및 추출물의 농업적 활용사례는 적으나 클로렐라 실내배양조건을 빛과 암 상태로 조절하면 식물생장 조절제인 옥신과 사이토키닌이 증가하는 결과가 보고된 바 있다(Stirk et al., 2014). 클로렐라 (C. vulgaris)와 길항미생물 인 Stenotrophomonas maltophilia와 혼합하고 캡슐화하여 토 양개량제로 레드클로버의 근권에 처리하였을 때 식물근권 미 생물과 상호작용하여 뿌리와 지상부 신장을 증진한다고 하였 다(Raposo and De. Morais, 2011).

클로렐라 추출물이 유기농 허용자재로 등록되어 클로렐라 의 농업에서의 이용은 점차 확대되어 가고 있다. 본 연구는 혐기소화액을 배지로 클로렐라(Chlorella fusca)를 배양한 배양 액 처리가 페레니얼 라이그라스 종자의 발아에 미치는 영향을 연구함으로써 클로렐라의 농업적 활용도를 높이고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시 재료

종자 발아 시험은 시험 결과의 신뢰성을 확보하기 위하여 3차례 실험을 수행하였다. 1차 실험은 2016년 5월 21일부터 2016년 6월 4일까지, 2차 실험은 2016년 7월 12일 부터 7월 25일까지 수행하였으며, 3차 실험은 2016년 10월 24일부터 2016년 11월 6일까지 수행하였다. 공시작물은 페레니얼 라이 그라스의 (Lolium perenne L.) 품종 Linn을 국립축산과학원에 서 분양 받아 냉장고에서 보관된 종자를 사용하였다.

클로렐라 배양 배지로 사용한 공시 액비는 경기도 이천시 에 소재하는 도드람환경연구소에서 운영하는 혐기소화발효 액을 클로렐라 배양 영양배지로 사용하였다. 가축분뇨 혐기 소화발효액의 화학적 성분은 Table 1과 같다. 성분함량은 총 질소 108 mg/L, 인산 49 mg/L, 칼륨 2,459 mg/L 이었다. pH 는 8.08, EC는 10.2 dS/m 이었다. 혐기소화발효액은 칼륨함량 은 높으나 질소, 인산, 마그네슘 함량은 낮았다.

2. 클로렐라 배양

본 연구에 사용된 클로렐라 균주(Chlorella fusca)는 농촌진 흥청으로부터 분양 받아 계대배양으로 보관된 균주를 사용하 였다. 클로렐라 배양을 위한 표준영양원으로 BG11(Andersen, 2005)을 사용하였다. 순수 분리한 클로렐라 균주의 종균을 배 양하기 위해 100 ml T-플라스크에 70 ml의 액상 BGMM배지 (50 mg/L Ampicillin, 100 mg/L Chloramphenicol)에 접종하였 다. 또한 4일간 배양 후 순수 분리한 클로렐라 종균의 배양은 100ml T-플라스크에 70ml의 액상 BG11배지(50mg/L Ampicillin, 100mg/L Chloramphenicol)에 접종하여 4일간 배양 후 클로렐 라 배양용으로 제작한 10L 용량의 광과투성 polyvinyl bag 배 양기에 4L의 액상 BG11배지를 넣고 클로렐라 균주의 종균을 접종하여 7일간 배양 후 실험에 사용하였다. 이 때 배양기는 기포발생기를 이용하여 15 L/분의 공기를 공급해 주었다.

3. 처리 내용

클로렐라 배양액 처리가 페레니얼 라이그라스 발아에 미치 는 효과를 검토하기 위한 종자 발아시험의 처리는 Table 2와 같다. 처리구는 혐기소화발효액, 클로렐라 배양액, 클로렐라 배양여액 처리구와 클로렐라 배양액을 처리하지 않은 무처리 구(물)를 두었다. 혐기소화발효액 처리구는 클로렐라액비 배 양시 배지로 사용한 혐기소화발효액 4% 희석액을 처리하였 다. 클로렐라 배양액은 4% 혐기소화발효액을 배지를 이용하 여 배양한 클로렐라 배양액을 처리구로 두었다. 클로렐라 배 양 여액은 클로렐라 생균을 제거한 후 처리효과를 구명하기 위하여 처리구를 두었다. 클로렐라 배양여액 제조 방법은 원 심분리기 (RPM 3600)를 이용하여 침전된 균체를 제외한 상 등액만을 사용하였다. 종자 발아시험시 클로렐라 배양액 처 리량은 90mm 페트리디쉬 당 5ml를 주입하였고 대조구는 증 류수를 같은 양 주입하였다.

4. 클로렐라 배양액 종자 발아 시험

종자 발아시험 방법은 종자발아법에 의거하였다. 종자는 페트리디쉬(9.0 × 1.5cm)에 흡습지 (Whatman No.2)를 깔고 50립을 치상하고 4반복으로 수행하였다. 대조구에는 수도물 5ml를 투입하고 처리구에는 해당 처리물질을 5ml씩 투입하 고, 대조군과 처리군 공히 4반복으로 처리하였다. 생육상의 온도는 25±1℃, 습도 85±1% 조건이었으며 배양기에 인공 적인 빛은 조사하지 않았다. 치상 후 72시간 후에 페트리디쉬 내의 수분을 점검하여 필요시 모든 페트리디쉬에 증류수 3ml 를 보충하고 다시 파라필름을 감아 수분 증발을 막았다.

5. 종자 발아 분석 방법

본 연구에서 클로렐라 배양액을 대상으로 식물발아 및 생 장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 치상 후 최대 14일까지 발아 특성을 조사하였다. 조사항목은 발아율, 발아 소요일수, 뿌리길이를 조사하였고, 클로렐라 배양액 종자독성를 알아보 기 위해 발아지수(GI)값을 구하였다. 발아조사는 종자를 치상 후 1일 간격으로 조사하였다.

발아속도(germination speed)는 발아율이 50, 70%에 도달하 는데 소요된 일수(T50, T70 days)를 계산하였다.

뿌리길이는 종자발아 종료 후에 조사하였다. 상대발아율 (GR), 상대뿌리 신장율(RE)은 아래 공식을 이용하여 계산하 였다.

6. 통계 분석

통계분석은 MS-EXCEL 2010과 SAS(version 8.0)를 활용하 여 분산분석을 하였고, 처리후 평균구간의 비교는 Duncan의 다중검정을 실시하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 발아율

클로렐라 배양액 처리가 페레니얼 라이그라스 종자 발아에 미치는 영향을 분석한 1차 실험 결과는 Table 3과 같다. 페레 니얼 라이그라스 종자의 최종발아율은 클로렐라 배양액 처리 구가 85.7%로 무처리구의 59% 보다 26.7% 높았다. 발아 일 수는 1차 시험에서 10~11일 소요되었다. 무처리 페레니얼 라 이그라스 종자는 치상 후 2일 경부터 발아하기 시작하여 9일 이 지나야 55.7%의 발아율을 보였지만, 클로렐라 배양액 처 리 종자는 치상과 더불어 발아하기 시작하여 9일째 82%이상 의 발아율을 보여 발아촉진을 위한 클로렐라 배양액 처리 효 과를 잘 반영해 주었다. Dobrzański et al. (2008)은 0.5% 조류 배양용액의 처리가 양파 및 파슬리 종자의 발아율을 증진하 였다고 보고하였다. 클로렐라 배양액 종자의 발아촉진은 클 로렐라 배양액 이용한 처리구는 뚜렷한 효과를 보였지만, 클 로렐라 배양여액의 최종발아율은 73.3%를 나타내어 클로렐 라 배양여액의 발아촉진 효과는 높지 않았다.

혐기소화발효액를 배지로 이용한 클로렐라 배양액이 페레 니얼 라이그라스 종자 발아에 미치는 영향에 대한 2차 시험 결과는 Table 4와 같다. 종자 치상 후 9일에 클로렐라 배양액 을 처리하지 않은 무처리구(물)는 71%의 발아율을 나타내었 으나클로렐라 배양액 처리구는 82.7%가 발아하여 무처리구와 비교하였을 때 11.7% 더 많이 발아하였다. 클로렐라 배양액 처리가 무처리구에 비교하여 발아율이 현저히 향상되었다.

3차 시험에서는 치상 후 9일에 클로렐라 배양액을 처리하 지 않은 무처리(물)의 발아율은 70.7%, 혐기소화발효액 처리 구는 79% 이었으나 클로렐라 배양액 처리구는 94.3%, 클로 렐라 배양여액 처리구는 92.7% 발아하였다. 최종발아율은 클 로렐라 배양액 처리구가 97.7%로 무처리구의 77.3%와 비교 하여 20.4% 높았다. 3차 반복 실험 결과 클로렐라 배양액과 배양여액 처리구가 무처리구와 비교하여 발아율이 증가하였 다. Dobrzański(2008)는 0.5% 조류 배양용액의 처리가 양파 및 파슬리 종자의 발아율을 증진시켰다고 보고하였다.

2. 상대 발아율

클로렐라 배양액 처리가 페레니얼 라이그라스 종자의 상대 발아율에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 6과 같다. 1, 2, 3차 시험 결과 클로렐라 배양액 처리구는 무처리구보다 상대 발아율 (relative germination rate, %)이 각각 148, 125, 127% 높았다. 클로렐라 배양여액 처리구의 상대발아율도 무처리와 비교하여 25% 높았다. 클로렐라 배양액과 배양여액 처리구 는 무처리(물) 및 혐기소화발효액과 비교하여 상대발아율이 상승하는 결과를 나타내었다. 식물의 생장과 수량은 다양한 천연 첨가제의 사용에 의하여 개선 할 수 있다. 조류는 식물 생장조절제로 내생 옥신(auxin)과 사이토키닌(cytokinin)을 함 유(Stirk et al., 2014)하고 있어서 식물의 발아를 촉진(Hong et al., 2007) 및 초기 생육 촉진 효과가 있는 것으로 보고하였다 (Seo et al., 2016). Table 5

3. 발아 속도

발아속도(Germination Speed, %)는 발아율이 50, 70%에 도 달하는데 소요되는 일수(T50, T70, days)를 조사하였다. 페레 니얼 라이그라스 종자의 발아율이 50% 도달할 때까지 소요 되는 일수(T50)는 클로렐라 배양액 처리구에서 1, 2, 3차 시 험에서 각각 3.5, 3.3, 5.9일로 무처리(물)의 4.9, 4.7, 7.5일보 다 평균 1.7일 빨랐다. 페레니얼 라이그라스 종자의 50% 발 아 소요일수(T50)은 무처리 종자가 5.7일인데 비해 클로렐라 배양액 처리 종자가 4.2일로 1.3일 이상 단축되는 경향을 보 였다.

70% 발아 소요일수(T70)는 클로렐라 배양액 처리구에서 7.6일로 혐기소화발효액 9.9일, 클로렐라 배양여액 처리구의 10일과 비교하여 2.5일 빨랐다. 2차 시험에서 T70은 클로렐 라 배양액 처리구가 7.4일로 가장 빨랐고, 혐기소화발효액 처 리구는 8.2일, 클로렐라 배양여액 처리구는 9.2일이 소요되었 다. 3차 시험에서 T70%은 클로렐라 배양액 처리구가 7.4일로 다른 처리구와 비교하여 빠른 발아속도를 나타내었다.

본 연구에서 클로렐라 배양액 처리구의 발아소요일수가 무 처리(물)와 비교하여 단축되었는데 (Stirk et al., 2014)은 클로 렐라의 성장과 내성호르몬에 대한 빛의 효과에서, 빛 조사의 유무에 따라 옥신, 지베렐린, 사이토키닌 등의 식물생장조절 제(plant growth regulators) 영향이라고 보고하였다.

4. 뿌리길이

페레니얼 라이그라스 종자에 클로렐라 배양액을 처리하여 뿌리길이에 어떠한 영향을 주는지 3차 실험을 통하여 조사한 결과는 Table 8과 같다. 뿌리길이의 평균값은 클로렐라 배양 액 처리구가 5.5cm로 무처리구의 4.1 cm보다 1.4cm 길었다. 클로렐라 배양여액 처리구의 뿌리길이는 무처리(물)와 비교 하여 유의한 차이를 나타내지 않았다. 클로렐라(C. vulgaris) 와 길항미생물인 Serratia proteomaculans와 혼합하고 캡슐화 하여 토양개량제로 레드클로버의 근권에 처리하였을 때 식물 근권 미생물과 상호작용하여 뿌리와 지상부 신장을 증진한다 고 보고하였다(Raposo and De. Morais, 2011). Table 7

5. 상대 뿌리신장율

클로렐라 배양액 처리가 페레니얼 라이그라스 종자의 상대 뿌리 신장율에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 9와 같다. 1, 2, 3차 시험 결과 상대 뿌리신장율은 클로렐라 배양액 처 리구가 무처리구보다 41% 증가하였다. 상대 뿌리 신장율은 혐기소화발효액 처리구는 무처리(물)와 비교하여 유의한 차 이를 나타내지 않았다.

6. 발아지수

클로렐라 배양액 처리가 페레니얼 라이그라스 종자의 발아 지수(GI)에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 10과 같다. 발 아지수는 상대발아율(GR, relative gemination ratio)과 상대뿌 리지수(RE, relative root length)를 곱한 값으로 나타내었다. 발 아지수는 식물 종자를 대상으로 미숙퇴액비 중에 존재하는 여 러 가지 독성물질에 의한 피해를 간접적으로 측정하는 것으로 종자 발아율과 뿌리생장률을 통해 독성여부를 평가하는 방법 이다(Paik et al., 1998). 1, 2, 3차 시험 결과 발아지수 (GI, germination index)의 평균값은 클로렐라 배양액 처리구가 187.7로 무처리(물) 보다 월등히 높았다. 클로렐라 배양여액 처리구의 발아지수는 142.7로 무처리구보다 높았다. 퇴비의 경우 발아지수가 70이상이 식물종자의 발아와 식물생장에 나 쁜 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다(Morel et al., 1985). 클로렐라 배양액의 유해성 평가는 독성 평가가 주를 이 루는데 클로렐라 배양액은 발아지수 조사 결과 발아독성이 없 어 종자 발아에 안정성이 높은 친환경농자재로 평가되었다.

7. 페레니얼 라이그라스 종자의 부패율

클로렐라 배양액 처리가 페레니얼 라이그라스의 부패율에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 11과 같다. 페레니얼 라 이그라스 부패율은 무처리구가 발아 7일에 10%로 나타났으 나 클로렐라 배양액, 배양여액 처리구에서는 부패된 종자가 나타나지 않았다. 처리 9일 후 클로렐라 배양액을 처리하지 않은 무처리(물)는 페레니얼 라이그라스 종자가 검게 부패되 고 시들고 약 36.7% 부패율을 보였으나 클로렐라 배양액 처 리구는 13.3%로 부패율이 낮았다. 치상후 11일째에 무처리구 의 종자 부패율은 86.7%로 높았으나 클로렐라 배양액 처리구 의 부패율은 50%로 현저히 낮았다. 또한 클로렐라 배양여액 처리구의 부패율은 53.3%를 나타내어 무처리(물)와 비교하였 을 때 부패율이 낮았다. 클로렐라 배양액과 미네랄 팩을 처리 한 콩나물은 부패가 방지 된다고 보고하였다. 특히 0.5~1.0% 농도로 클로렐라 처리는 콩나물 미생물의 증식 속도가 20~35% 감소하는 것으로 보고하였다(Kim et al., 2003).

본 연구에서는 클로렐라 배양액 처리가 페레니얼 라이그라 스 종자 발아시 부패율 방지에 효과가 있는 것으로 나타났다. Kim et al., (2014)의 연구에서 클로렐라(C. vulgaris)의 엽면처 리구와 무처리구를 비교하였을 때, 엽면처리구의 ‘설향’과 ‘육보’ 딸기 품종의 부패율은 무처리(물)에 비해 각각 63.8% 와 74.4% 감소하였다고 보고된 바가 있다. 조류에 의해 식물 병이 억제되는 사례는 이미 보고되어 있다. 주로 해초로 불리 는 바다 조류에서 항균활성을 지닌 물질이 발견되었으며 이 들의 추출물에 의해 부패율이 억제된 것으로 보인다(Kulik, 1995).

Ⅳ. 요 약

본 연구는 혐기소화발효액을 배지로 이용하여 클로렐라를 배양한 배양액이 페레니얼라이그라스 종자 발아에 미치는 영 향을 구명하기 위하여 혐기소화발효액, 클로렐라 배양액, 클 로렐라 배양여액, 혐기소화발효액, 무처리구(물)을 처리하여 종자 발아시험을 수행하였다. 페레니얼 라이그라스 종자의 최종 발아율은 무처리구의 70.2%와 비교하여 클로렐라 배양 액 처리구가 91.9%로 21.2% 높았다. 또한 상대발아율도 클로 렐라 배양액 처리구가 클로렐라 배양액을 처리하지 않은 무 처리구(물) 보다 25% 높았다. 페레니얼 라이그라스 종자의 50% 발아에 소요되는 일수(T50)는 클로렐라 배양액 3.3~3.5 일로 무처리구의 4.7~5.1일보다 빨랐다. 페레니얼 라이그라스 종자의 뿌리길이는 클로렐라 배양액 처리구가 무처리(물)보 다 1~2cm이상 길었다. 상대적 뿌리신장율은 클로렐라 배양액 처리구의 무처리구보다 40% 높았다. 페레니얼 라이그라스 종자의 발아지수(GI)는 클로렐라 배양액 처리구가 182로 무 처리구(물)의 100 보다 높았다. 종자의 부패율은 치상 후 11 일째에 무처리구와 혐기소화발효액 처리구가 각각 83.3, 86.7%으로 높았으나 클로렐라 배양액 처리구는 50.0%로, 클 로렐라 배양여액 처리구가 53.3%로 부패율이 낮았다. 클로렐 라 배양액, 클로렐라 배양여액 처리가 종자의 부패방지 효과 를 나타내었다.