Ⅰ서 론

최근 분자생물학의 발전으로 작물들에서 DNA를 이용한 분자표지인자 시스템이 개발되면서 정밀한 유전자 지도, 유 전적 다양성 분석 및 농업적으로 중요한 작물의 형질간의 유 전적 연관을 활용한 연구를 활발히 진행하고 있다(Kim et al., 2014). 과거 RFLP, RAPD, AFLP 기법 등은 유전적 다양성 및 집단구조의 평가에 널리 활용되었으나, 최근 Next Generation Sequencing(NGS) 시대를 맞아 Simple Sequence Repeat(SSR) 및 Single Nucleotide Polymorphism(SNP) 등을 이용한 DNA 분석기법들이 활용되고 있다. 분자마커 기술은 작물의 다양 한 유전적 변이성과 계통의 유연관계 등에 대한 정보 제공을 할 수 있기 때문에 신품종의 개량이나 자식 계통의 육성 및 발굴, 그리고 품종보호권 강화 등 다양한 육종 프로그램에 이 용할 수 있다(Kim et al., 2016; Park et al., 2009). 이런 기법들 중 SNP는 기존 마커들에 비해 고밀도의 유전자 지도를 작성 하는데 활용되고 있으며, DNA chip, 대립유전자 특이 PCR (allele specific PCR), 프라이머 확장(primer extension) 등을 이용한 high-throughput 기술을 이용하여 마커 개발 전 과정 이 고속, 자동화의 장점이 있어 널리 이용되고 있다(Agarwal et al., 2008).

옥수수(Zea mays L.)는 세계 3대 작물 중 하나로서 밀, 벼 와 함께 세계 여러 지역에서 식용, 사료용, 공업용 등 다양하 게 이용하고 있다. 특히 미국, 유럽에서는 옥수수가 농후사료 나 사일리지용으로 많이 사용하고 있으며, 국내에서는 기존 수입 사료용 옥수수에 비해 쓰러짐에 강하고 건물수량이 많 은 광평옥, 장다옥, 평강옥 등 사료용 옥수수 품종은 품종을 개발하였다(Moon et al., 2001; Son et al., 2004; Son et al., 2009). 그러나 국내에 재배되고 있는 사료용 옥수수는 대부분 수입종이며, 40품종 이상이 국내에서 판매되고 있다. 2014년 국내 옥수수 수입량은 약 10,138천 톤으로 그 중 약 80%인 8,104천 톤이 사료용 옥수수로 이용되고 있다(Kim et al., 2016). 더욱이 사료용을 포함한 옥수수의 국내 곡물 자급도는 1%에 불과하기 때문에(Son et al., 2015), 수입량 감소, 곡물자 급을 향상, 유전자원에 대한 주권강화를 위해서는 국내 환경 에 맞는 우수한 옥수수 신품종 개발 및 분자마커를 활용한 품 종 보호권 강화가 필요하다.

따라서 본 연구에서는 최근 single-nucleotide amplified polymorphisms(SNAP)을 기반으로 대립유전자 특이 PCR를 통해 애기장대 SNP 분석 방법(Drenkard et al., 2000) 을 변형 한 two-base pair mismatch SNP 방법을 이용하여 국내․외에서 개발된 사료용 옥수수의 품종을 판별하기 위해 SNP 분자마 커를 탐색하고자 하였다.

Ⅱ재료 및 방법

SNP 분석을 위해 사용된 옥수수는 국내․외에서 개발된 사 료용 옥수수 50품종 및 국내 사료용 옥수수 모․부본을 유묘기 에 어린잎을 채취하여 Kim et al. (2011) 의 방법을 약간 변형 하여 Genomic DNA를 추출하였다. 액체질소를 이용하여 잎 을 곱게 분쇄한 후 추출버퍼(7 M Urea, 350 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.6, 20 mM ethylenediaminete- traacetic acid [EDTA] 와 2% sodium dodecyl sulfate)를 넣은 후 65℃에서 10분간 배양시켰다. 추출된 genomic DNA 상등액에 phenol/ chloroform/isoamyl alcohol(25:24:1 volume) 용액을 넣고 잘 혼합시킨 후 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 취하여 isopropanol로 침전시켰다. 침전물을 70% ethanol로 세척한 다음 실온에서 충분히 말리고 Tris-EDTA 버퍼(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4)에 녹여 SNP PCR분석에 사용하였다.

사료용 옥수수 품종 판별 마커 개발을 위해서 선행 연구에서 개발한 16개의 SNP primer을 기본으로 사용하였다(Kim et al., 2016). MaizeGDB database (www.maizegdb.org)을 통하여 옥수 수 표준유전체 B73 genome map에서 SNP 위치를 검색하였다. 이 SNP 위치를 바탕으로 Primer Designer 4(Sci-Ed Software, Denver, CO, USA) 프로그램을 이용하여 증폭온도, 올리고머의 길이, 그리고 PCR 생성물의 크기 등을 최적화 하고, forward primer의 C-terminal 끝 바로 앞 염기서열이 B73 표준 map과 다르게 프라이머를 제작하였다. SNP PCR 증폭에서 용액은 총 25 ㎕ 볼륨으로 GoTaqⓇ Green Master Mix 2X(Promega, Madison, WI, USA) 12.5 ㎕와 20 ng의 genomic DNA, 10 μM forward 와 reverse primers, 그리고 멸균증류수를 혼합하여 실 시하였다. PCR 반응은 처음 95°C에서 2분간 최초 denaturation 한 후, 다음 95°C에서 30초간 denaturation, 46°C∼60°C에서 1 분간 annealing, 72°C에서 5분간 extension을 하였다. PCR 생성 물 전기영동은 1.5% agarose gel에서 수행하였다.

선행 연구결과를 통하여 개발된 16개의 SNP forward primer 는 C-terminal 끝 바로 앞 2번째 염기서열이 B73 표준 map과 다르게 primer를 제작하여, 비교 옥수수 품종 혹은 계통에 SNP site가 있을 경우 2bp가 달라PCR 생성물이 생기지 않게 제작되었다(Table 1)(Kim et al., 2016). 이렇게 제작되고 선발 된 16개 SNP primer sets을 바탕으로 국내에서 개발된 사료용 옥수수 10 품종(강다옥, 광평옥, 다평옥, 안다옥, 양안옥, 신광 옥, 장다옥, 청다옥, 평강옥, 평안옥) 및 그의 모․부본의 구별성 을 검정하기 위하여 PCR을 수행하였다(IBM440, IBM471, IBM516, IBM535, IBM549, IBM580, IBM652, IBM795, IBM911, IBM960, IBM1118, IBM1269, IBM1492, IBM1601, IBM1619, 그리고 IBM1798). 염색체 2번에서 SNP site를 검정 할 수 있는 primer sets은 IBM440, IBM471, IBM516, IBM535, 그리고 IBM549 이었으며, IBM795, IBM911, IBM960는 염색 체 4번, IBM1492, IBM1601, IBM1619는 염색체 8번, IBM580, IBM652는 염색체 3번, 그리고 염색체 5번, 6번, 9번에서 IBM1118, IBM1269, IBM1798이 각각 한 개씩 확인되었다.

모든 옥수수 품종 및 계통 대한 분류를 위해서 PCR 생성 물의 유․무를 scoring하여 실시하였다. 이를 바탕으로 PROC CLUSTER procedure(SAS ver. 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA)을 바탕으로 Cluster analysis를 수행하였다.

Ⅲ결과 및 고찰

미국 표준 옥수수인 B73의 게놈 염기서열의 분석(Schnable et al., 2009)이 완료된 후, mapping population에 대한 SNP분 석을 위해 SNAP assay방법이 널리 이용되고 있다(Drenkard et al., 2000). 최근 찰옥수수 품종판별에서 개발된 SNP primer set을 이용하여 국립식량과학원에서 개발된 사료용 옥수수와 해외에서 수입된 옥수수의 품종 판별 가능성을 검정하고자 하였다(Kim et al., 2016). 16개 SNP primer 조합 중 IBM911 primer 조합으로 강다옥, 안다옥을 제외한 8개 품종에서 SNP site를 확인하였으며, IBM1492 primer 조합으로는 다평옥, 청 다옥, 평가옥을 제외한 7개 품종에서 SNP site를 하였다. 그리 고 IBM535 primer 조합은 다평옥, IBM549, IBM580 primer 조합은 장다옥만 SNP site가 존재함을 검정하였다(Fig. 1).

16개의 SNP primer을 이용한 PCR 수행을 통해 국내 사료 용 옥수수 및 그의 모․부본간의 SNP site 재현성 및 유전력 검 정도 함께 실시하였다. Table 2는 SNP PCR을 통해 PCR 생산 물 유․무를 1은 생성(SNP site 존재하지 않음), 0은 생성되지 않은 것(SNP site 존재)으로 도표화 하였다(Table 2). 이 결과 를 통하여 16개의 선발된 SNP primer 조합은 사료용 옥수수 모․부본과 품종간의 SNP primer의 재현성 및 SNP site의 유전 력을 검정 가능케 하였다.

국산 사료용 옥수수 10품종과 국내 수입 사료용 옥수수로 판매 가능한 40품종의 옥수수 잎을 샘플링하고 DNA을 추출 하여 16개의 SNP primer을 이용하여 구별 가능성을 검정하였 다. 그 결과 Figure 2에서 보는 것과 같이 PCR 생성물이 비특 이적인 밴드가 존재하지 않는 단일밴드 유․무로 나타남을 확 인하였다(Fig. 2).

이를 통해 국산 사료용 옥수수 10품종은 16개의 SNP primer를 통해 모두 판별 가능하다. 그러나 수입 사료용 옥수수 40종과의 구별성 검정에서는 광평옥은 31A12, 안다옥과 평안 옥은 31N27, 양안옥과 DK8868이 비슷한 유전적 거리에 있는 것으로 분석되었다(Fig. 3). 국산 사료용 옥수수 Shingwangok (신광옥)과 P1395는 구별되지 않으며, DKC61-24와 34N43, RX772와 32D99, DKC61-42와 DKC62-25, P1543과 P1758 그 리고 32P75, P1921과 P3223은 구별되지 않았다(Fig. 3). 이러 한 결과는 16개의 SNP site의 유․무를 통한 클러스터 분석이 사료용 옥수수 품종 판별과 국산 사료용 옥수수의 모․부본에 서의 유전적 다양성 검정에 유용하게 적용될 수 있으나, 수입 사료용 옥수수는 그들의 모․부본에 대한 종자 확보가 힘들어 유전적 다양성을 모두 담아내지는 못하는 것으로 판단되다. 따라서 이들을 유전적 다양성을 구별하기 위해서는 더 많은 SNP primer 조합과 수입 사료용 옥수수 유전자원이 요구되어 진다.

시중에 판매되는 사료용 옥수수 40 품종과 국산 사료용 옥 수수 10품종 구별을 위하여 선발된 16개 SNP primer 조합을 이용하여 최소 primer 조합수를 검정하였다. 이들 중 IBM911 와 IBM1798 primer 조합을 통해서 국내 사료용 옥수수인 강 다옥에서 PCR 생성물이 생성됨으로써 SNP가 존재하지 않음 을 확인하였고, IBM1798 primer 조합은 PCR 생성물 생성되 지 않아 SNP가 존재하지 않으므로 이 두 조합을 통해서 전체 50품종 중에서 강다옥을 판별 가능한 조합으로 확인하였다 (Figure 4A). IBM440과 IBM549 primer 조합은 장다옥(Figure 4B), IBM440과 IBM1269 priemr 조합은 평강옥(Figure 4C), IBM795와 IBM1601 primer 조합은 평안옥(Figure 4D)을 판별 할 수 있는 최소 조합인 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 SNP site 주변의 염기서열에 따라 변형된 2bp 불일 치 SNP PCR 방법이 사료용 옥수수 품종판별 마커로써 활용 가능성이 높음을 확인하였다.

본 연구는 4bp 불일치 primer를 사용하는 기존의 SNP 분석 방법(Newton et al., 1989; Kwok et al., 1994)을 변형한 2bp 불 일치 primer으로도 품종판별과 유전력을 충분히 판별할 수 있 는 것으로 검정되었다. 그러나 200개의 primer 조합 중 16개 의 primer 조합만이 품종판별 마커로써 활용 가능한 이유는 아마도 2bp 불일치 주변의 염기서열 따른 특이적 SNP primer 디자인에 실패한 것으로 예상된다(Mendelman et al., 1989; Huang et al., 1992). Fig. 4

이러한 연구는 기존의 High-throughput SNP 탐색 방법들 (Ahmadian et al., 2000, Alderborn et al., 2000)에 비하여 특수 한 장비나 정교한 방법이 필요하지 않은 agarose 전기영동 방 법을 통하여 손쉽게 SNP site 유․무를 검정할 수 있으며, 비용 절감효과도 이룰 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 특이적 SNP primer 개발 효율성을 높이기 위한 연구가 지속적으로 수행되어져야 할 것으로 판단된다.

Ⅳ요 약

옥수수 품종판별 마커 개발을 위하여 SNAP 방법을 변형 하여 2bp 불일치 SNP PCR 방법을 옥수수 품종판별에 적용 하였다. SNP 마커개발을 위하여 MaizeGDB 웹사이트 (www.maizegdb.org)를 통해서 200 SNP 위치를 확인하였으 며, 표준맵으로 알려진 B73 옥수수 게놈서열을 바탕으로 2bp 불일치 Primer을 디자인하였다. PCR 생성물은 200-500bp 사 이에서 결정되었으며 SNP site가 있을시 PCR 생성물이 생성 되지 않게 디자인 되었다. 선행연구에서 선발된 16개의 Primer조합을 이용해서 농촌진흥청에서 개발된 사료용 옥수 수 10품종(강다옥, 광평옥, 다평옥, 안다옥, 양안옥, 신광옥, 장다옥, 청다옥, 평광옥, 평안옥)과 수입 사료용 옥수수 40품 종과의 판별 가능성을 검정하였다. SNP PCR 결과를 바탕으 로 한 Cluster분석에서 신광옥과 PI1395 그리고 몇몇 수입 사 료용 옥수수를 제외하고는 모두 판별 가능한 것으로 검정되 었다. SNP 통한 품종판별 최소조합수를 선발한 결과 강다옥 은 IBM911과 IBM1798, 장다옥은 IBM440과 IBM549, 평강 옥은 IBM440과 IBM1269, 평안옥은 IBM795와 IBM1601였 다. 이는 SNP 마커 개발을 통해 빠르고, 손쉽게 품종판별이 가능한 마커로 활용가능하다는 것을 보여준다.