I.서 론
작물은 생육기간 동안 자연환경에서 빛, 수분 그리고 온 도 등과 같은 다양한 환경 요인에 의해 지속적으로 영향을 받는다. 특히, 고염과 건조 스트레스에 의해 야기되는 수분 스트레스 및 독성 이온들의 축적은 작물의 생산성과 품질 에 가장 광범위하게 영향을 주는 요인 중 하나이다 (Ma et al., 2009). 또한 작물은 고염, 건조, 저온, 습해 등을 포함 하는 대부분의 환경 스트레스에 대한 공통된 반응으로 singlet oxygen, superoxide, hydrogen peroxide와 같은 활성 산소종 (ROS)의 생성에 따라 작물의 생장의 저하를 가져온 다. 이와 같이 작물이 다양한 환경스트레스에 노출되면 새 로이 유도되는 유전자 발현 조절 등의 변화로 환경조건에 순화 및 적응하게 된다 (Santiago et al., 2009). 초지는 가축 방목을 위한 안정적인 조사료 공급원일 뿐만아니라 토양보 존용 등으로도 중요성이 강조되고 있다. 그러나 목초는 대 부분 외국도입 초종으로 우리나라의 기후조건에서 재배할 경우 여러 가지 환경재해에 직면하게 되어 그 수량성과 품 질이 현저히 저하되고 있다. 또한 기후변화로 초지조성 초 기에 목초의 동해, 여름철 기온이 몹시 높고 일조량이 많 아 고온장해, 장마시 다습 및 강수량이 집중되어 목초의 생육 지장 및 가을부터 이듬해 초여름까지 가뭄영향으로 인한 토양수분 부족 현상 초래 등으로 많은 피해가 발생하 고 있다 (Wallner et al., 1982; Rizhsky et al., 2002). 따라서 급격한 환경변화에 적응할 수 있는 신품종 목초의 개발과 기술보급이 절실한 실정이다.
톨 페스큐 (Festuca arundinacea Schreb.)는 환경에 대한 적응성과 영속성이 우수한 초종중의 하나이다 (Moser and Hoveland. 1996). 최근 국내에서도 톨 페스큐 신품종 (Choi et al., 2010; Lee et al., 2012) 개발에 관한 연구들이 활발 하게 진행되고 있다. 또한 전 세계적으로 DNA microarray, T-DNA tagging, proteomics 및 bioinformatics (Rouf Mian et al., 2008; Zhang et al., 2004; Saha et al., 2005; Zhan et al., 2005) 등의 유전학과 분자생물학적인 접근을 통해 환 경스트레스에 대한 반응과 적응 메커니즘에 관한 많은 연 구들이 수행되고 있다.
본 연구는 톨 페스큐 품종개발에 필요한 기초자료를 확 보하기 위하여 염 또는 건조 스트레스에 의한 톨 페스큐의 초기 발아에 미치는 발아 반응과 이들 스트레스들에 의한 유전자 발현 양상 등을 조사하여 향후 광범위한 스트레스 내성을 부여할 수 있는 기술을 개발하고자 한다.
II.재료 및 방법
1.식물재료 및 종자의 살균
식물재료는 톨 페스큐 (Festuca arundinacea Schreb.)의 품종 중 국외에서 수집한 Kentucky-31(E-)과 Fawn 및 국내 에서 육성된 Greenmaster 3가지 품종을 사용하였다. 종자는 Lee 등 (2012b)의 방법에 따라 소독한 후 무균대에서 멸균 된 filter paper에 옮겨 물기를 제거하고 NaCl 및 PEG (polyethylene glycol-6000)가 농도별 첨가된 배지에 25개의 종자를 3반복으로 치상하였다.
2.스트레스 처리 및 품종간 발아율 조사
NaCl 또는 PEG 처리가 톨 페스큐의 발아율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 1/2MS (Murashige와 Skoog, 1962), 15 g/L sucrose 및 3 g/L Gelrite를 첨가된 기본배지를 이용 하여 in vitro 조건에서 실시하였다. 염 처리에 의한 품종간 발아율을 조사하기 위하여 무처리구인 대조구와 50, 150, 250 및 350 mM의 NaCl이 첨가된 기본배지를 사용하였다. 건조처리에 의한 품종간 발아율을 조사하기 위하여 무처리 구인 대조구와 5%, 10%, 15% 및 30% PEG가 첨가된 기본 배지를 사용하였다. 소독된 종자는 각각 NaCl과 PEG가 농 도별로 첨가된 배지에 치상한 후 24 ± 2°C, 16 h light/8 h dark 조건에서 2주간 배양한 다음 품종간의 발아율을 비교 조사하였다.
3.GeneFishing™ polymerase chain reaction 분석
염해 및 건조 스트레스 조건에서 톨 페스큐 유전자의 발 현양상을 조사하기 위하여 GeneFishing™ DEG 키트 (Seegene, Seoul, Korea)을 사용하여 분석하였다. Lee 등(2012)의 방법에 따라 annealing control primer (ACP)-based PCR 기법을 이용해 Differentially expressed genes (DEGs)를 스크린하였다. 증폭된 PCR 생산물을 2% 아가로스겔에서 전기영동시켜 분리하였다.
4.DEGs 염기서열 분석 및 Blast 검색
선발된 DEGs band는 GEL CLEAN II kit (Qiagene)를 이 용하여 gel elution 후, TOPO TA cloning vector (Invitrogen) system을 이용하여 cloning 하였다. 각각 clone은 ABI PRISM R3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)에 의 해 염기서열을 분석하여 NCBI의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 유전자의 정보를 탐색하 였다.
III.결과 및 고찰
1.염 스트레스가 톨 페스큐 발아율에 미치는 영향
NaCl 처리에 따른 톨 페스큐 품종별 발아율의 변화는 Fig. 1과 같다. 무처리구에서 톨 페스큐 3가지 품종 Kentucky-31(E-), Fawn, Greenmaster의 발아율은 각각 96%, 68.7% 및 34.7%로 나타났다. 50 mM 농도의 NaCl 처리시 부터 발아율이 서서히 감소하기 시작하였으며 250 mM 농 도의 NaCl 처리시 Kentucky-31(E-) 품종은 20% 이상의 발 아율을 보였지만 Greenmater는 1.3%, Fawn 품종은 발아가 전혀 되지 않았다. 이보다 고농도인 350 mM 농도 NaCl 처 리구에서는 모든 품종에서 발아가 되지 않는 경향을 보였 다. 모든 처리구에서의 NaCl 처리 농도에 따른 발아율 감 소율은 Fawn 품종이 가장 큰 변화를 보였으며 Kentucky- 31(E-) 품종이 가장 강한 내성을 보였다. 이러한 유사한 연 구결과는 Duan 등 (2007)에 의해 보고 되었다. Datta 등(2009)도 기내 배양 조건에서 5가지 밀 품종을 실험한 결 과 염 스트레스 처리시 종자 발아율에 유의한 수준으로 (P < 0.05) 영향을 미치며, NaCl 농도가 증가할수록 shoot과 root의 생체중과 건물 중량이 감소된다고 보고된 바 있다. 또한 저농도의 NaCl 처리구에서 shoot 및 root의 길이 생장 에 영향이 없었으나, 50 mM 이상의 농도에서는 shoot과 root의 길이 생장에 장해가 나타난다고 보고된 바 있다 (Datta et al., 2009). 본 연구결과에서는 내염성이 가장 약 한 것으로 판단되는 Fawn 품종에서 150 mM NaCl 처리에 서 발아율에 영향을 나타내었으며, 식물의 종에 따라 염 스트레스에 의한 종자 발아율과 초기생육에 미치는 영향의 정도가 다른 것에 기인한 것으로 판단된다.
2.건조 스트레스가 톨 페스큐 발아율에 미치는 영향
PEG 처리에 따른 톨 페스큐 발아율의 변화는 Fig. 2와 같다. 무처리구에서 Kentucky-31(E-), Fawn, Greenmaster의 발아율은 각각 95.0%, 39.7% 및 74.0%로 나타났다. 5% 이 상의 PEG 처리부터 모든 품종에서 발아율이 서서히 감소 하는 경향을 보였으며, 15% PEG 처리시 Kentucky-31(E-) 품종은 40% 이상의 발아율을 보였지만 Greenmater는 15.3%, Fawn 14.7%의 발아율을 나타났다. 이보다 고농도인 30% PEG 처리구에서는 모든 품종에서 발아가 되지 않는 경향 을 보였다. PEG 처리에 의해 Kentucky-31(E-) 품종이 가장 강한 내성을 보였다. 10% 이하의 PEG 처리구에서는 Fawn 품종이 가장 낮은 발아율을 나타내었으나, 15% PEG 처리 구에서는 Greenmaster와 Fawn 품종이 유사한 수준의 발아 율을 보였다. Li 등 (2013)의 연구에서도 PEG 처리에 의해 종자 발아율이 감소되었다고 보고된 바 있으며, 본 연구와 동일하게 30% PEG 처리에서는 종자의 발아가 되지 않는 경향을 보였다. 종자의 발아는 삼투압 조절 능력에 의하여 영향을 받게 되며, 고농도의 PEG 처리가 톨 페스큐 종자 의 발아 과정 중 수분흡수를 방해하는 것에 기인하여 종자 발아를 저해 하는 것으로 판단된다.
3.Differentially expressed genes 분석
국내육성 톨 페스큐 Geenmaster 품종을 이용하여 150 mM NaCl을 12시간 처리 또는 15% PEG를 24시간 처리한 후 각각의 시료로부터 total RNA를 추출하여 DEG 탐색 및 분석에 이용하였다. ACP primer를 이용한 PCR은 반응 의 안정성이 높고 반복 실험에서도 재현성이 높기 때문에 차별적으로 발현하는 유전자를 선발하는데 매우 유용한 방 법이다 (Lee et al., 2012a; Lee et al., 2011).
추출된 total RNA는 first strad cDNA로 합성되었고, 이 후 DEG 탐색을 위한 ACP-based GeneFishing™ PCR을 실 시하였다 (Fig. 3). 그 결과 NaCl 또는 PEG 처리에 따른 발 현량의 차이를 보이는 총 4개의 DEG를 선발하여 클로닝하 고 염기서열을 분석하였다. 무처리구에 비해 NaCl 처리시 3개의 DEG (2, 3 및 4번)가 증가하였고 감소하는 DEG는 확인 되지 않았다. PEG 처리에서는 3개의 DEG (DEG 1, 3, 및 4)가 증가하였고 1개의 DEG (DEG 2)가 감소하는 경 향을 나타내었다. 이 중 DEG 4는 NaCl과 PEG 처리시 동 시에 증가하는 경향을 보였다.
4.염기서열분석 및 homology 분석
선발된 DEG의 염기서열 정보를 이용하여 NCBI의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)의 database에서 상 동성을 분석하였다 (Table 1). 그 결과, blastx 검색에 의하 여 rubisco large subunit (DEG 1), microsomal glutathion S-transferase (GST) 3-like isoform 1 (DEG 2)이 확인되었다.
DEG 3과 DEG 4는 blastx 검색으로 유효한 결과를 얻지 못하여 blastn 검색을 실시한 결과, 일부 서열이 각각 mRNA for putative 및 GH3-1 mRNA 서열과 상동성을 가 지는 것으로 확인 되었다. 그러나 일부 서열만이 상동성이 확인 되어 DGE 유전자의 기능을 유추하기에는 매우 제한 적인 정보를 제공하고 있다. 따라서 cloning 시스템 최적화 조건을 개선하여 정확한 유전정보 서열을 획득하는 실험이 진행되어져야 할 것으로 판단된다.
Rubisco는 식물 잎 조직의 50% 이상을 차지하는 단백질 이며, 캘빈회로에서 5탄당에 CO2를 결합시켜 2개의 3탄당 을 만드는 광합성 과정에서 중요한 단백질 중에 하나이다. Asghari과 Ebrahimzadeh (2006)에 의하여 rubisco activity 조 절자인 rubisco activase가 건조 스트레스에 의하여 발현양 이 증가하는 것을 보고 하였다. 이러한 결과는 건조 스트 레스하에서 톨 페스큐가 생장에 필요한 에너지원인 포도당 합성효율 저하에 대응하기 위한 survival mechanism에 중요 한 역할을 할 것으로 추측된다.
Microsomal GST3-like isoform 1은 활성산소를 제거하는 대표적인 항산화 효소중의 하나이다. 식물에는 multigene family로 매우 다양한 GST isoenzyme들이 존재하지만, 이 들 GST isoenzyme들의 기능연구에 관한 연구는 거의 이루 어지지 않고 있다 (Dixon, 2002). GST gene family의 다양 한 isotype은 다양한 환경 스트레스에 다양하게 반응을 보 이며, 본 연구에서는 건조 스트레스에 의하여 microsomal에 존재하는 GST3-like isoform 1이 발현양이 감소하는 것으로 확인 되었다. 건조 스트레스에 의한 2차 산화스트레스로서 활성산소 생성이 유도되었을 것이며, GST 등의 발현 감소 는 세포내 활성산소의 양을 적절한 수준으로 조절하지 못 하여 부정적인 영향을 끼쳤을 것으로 판단된다 (de Carvalho, 2008). 그러나 이러한 유전자들은 고염이나 건조 스트레스 에서 발현 변화가 실존하는지에 대한 검증이 시행되어야 하며, 스트레스 조건에서 정확한 기능을 규명하는 연구가 필요할 것이다.
IV.요 약
염 또는 건조 스트레스 처리에 의한 톨 페스큐 종자의 발아율 변화와 유식물체 수준에서의 유전자 발현을 조사하 기 위하여 in vitro 조건에서 NaCl과 PEG를 처리하여 분석 하였다. NaCl 처리시 톨 페스큐 품종별 발아율은 50 mM 농도에서 발아율이 서서히 감소하기 시작하였으며 350 mM의 농도에서는 모든 품종에서 발아가 되지 않는 경향 을 보였다. NaCl 처리 농도에 따른 발아율 감소율은 Fawn 품종이 가장 큰 변화를 보였으며 Kentucky-31(E-) 품종이 가장 강한 내성을 보였다. 또한, PEG 처리시 톨 페스큐 품 종별 발아율의 변화도 NaCl 처리시와 유사한 경향을 보였 으며 고농도인 30% PEG 처리구에서는 모든 품종에서 발 아가 되지 않는 경향을 보였으며 Kentucky-31(E-) 품종이 가장 강한 내성을 보였다.
톨 페스큐 유식물체 수준에서 염해와 건조 스트레스에 의한 유전자 발현양상을 조사하기 위하여 DEGs (differentially expressed genes) 탐색을 위한 ACP-based GeneFishing™ PCR 분석을 통해 NaCl 또는 PEG 처리에 따른 발현량 의 차이를 보이는 총 4개의 DEG를 선발하여 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 무처리구에 비해 NaCl 처리시 4개 의 DEG가 증가하였고 감소하는 DEG는 확인 되지 않았으 나, PEG 처리에서는 3개의 DEG (DEG 1, 3, 및 4)가 증가 하였고 1개의 DEG가 감소하는 경향을 나타내었다. 발굴된 DEG들을 blastx 검색에 의하여 rubisco large subunit (DEG1), microsomal glutathion S-transferase (GST) 3-like isoform 1 (DEG2) 유전자로 동정되었다.
